[發(fā)明專利]一種豬II型圓環(huán)病毒ORF2蛋白的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210509316.4
• 申請日: 2012-12-04
• 公開（公告）號: CN102994518A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李朝陽;李明義;石喬
• 申請（專利權(quán)）人: 山東信得科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/70;C07K14/01;C07K1/22
• 代理公司: 北京恒都律師事務(wù)所 11395
• 代理人: 邸建凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種豬II型圓環(huán)病毒ORF2蛋白的制備方法。?

背景技術(shù)

豬II型圓環(huán)病毒(PCV2)是近年來新發(fā)現(xiàn)的動物病毒之一，屬于圓環(huán)病毒科，是一種二十面體對稱、無囊膜、單股環(huán)狀DNA病毒，病毒粒子直徑為17nm，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒。該病最早于1991年在加拿大西部發(fā)現(xiàn)，根據(jù)致病性的不同，被分為PCV-1和PCV-2。其中PCV-2對豬有較強的感染性，可經(jīng)口腔、呼吸道途徑感染不同年齡的豬，引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）等。感染豬出現(xiàn)進行性消瘦、行動遲緩、呼吸困難、黃疸、皮膚蒼白，甚至死亡，病原學(xué)及血清學(xué)調(diào)查表明，該病在許多國家都廣泛存在，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的損失。?

PCV-2基因組含ORF1和ORF2，ORF1編碼Rep蛋白，參與病毒復(fù)制，ORF2編碼233個氨基酸，是病毒的核衣殼蛋白(Cap)，具有良好的免疫原性，是構(gòu)建重組疫苗和臨床檢測的首選抗原。?

大腸桿菌表達系統(tǒng)不僅具有遺傳背景清楚，培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長繁殖快、成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點，而且其表達外源基因產(chǎn)物的水平遠高于其它基因表達系統(tǒng)，因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。另外，誘導(dǎo)劑乳糖是一種二糖，沒有毒性，價格低廉，其本身作為一種碳源，可以被菌體代謝利用，乳糖所具備的無毒和價廉的優(yōu)點，使得其在重組蛋白的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中，仍具有優(yōu)于IPTG的潛在價值和優(yōu)勢。

豬II型圓環(huán)病毒（PCV2）細胞培養(yǎng)滅活疫苗產(chǎn)量低且國內(nèi)缺乏對PCV2疫苗統(tǒng)一的生產(chǎn)檢驗方法及標(biāo)準(zhǔn)，這些問題已成為限制該類產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用的瓶頸；新型的疫苗如DNA疫苗，免疫效率還有待證實，而國外已有亞單位疫苗上市，能顯著降低病毒血癥，但價格昂貴。

豬II型圓環(huán)病毒ORF2蛋白亞單位疫苗中已有關(guān)于使用酵母和桿狀病毒表達ORF2蛋白的報道，但酵母表達系統(tǒng)繁瑣，可能存在蛋白切割的問題，而桿狀病毒則存在表達成本高，蛋白純化困難等缺點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種降低蛋白的損耗和生產(chǎn)成本的豬II型圓環(huán)病毒ORF2蛋白的制備方法。?

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：包括以下步驟：

1.序列合成

通過序列比對，在保證編碼的氨基酸相同的前提下改變核苷酸序列，把序列中的稀有密碼子替換成大腸桿菌偏愛密碼子，并在序列兩端分別加上EcoR?I和Not?I?限制性酶切位點，合成cap基因，連接到PES載體上，按照設(shè)定的限制性內(nèi)切酶進行酶切，將目的片段克隆至pMD18-T質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a細胞，挑取陽性菌落，OMEGA試劑盒小量提取質(zhì)粒，酶切鑒定陽性質(zhì)粒；

2．原核表達載體的構(gòu)建與鑒定

將質(zhì)粒pES-Cap經(jīng)EcoR?I和Not?I雙酶切，回收702bp的目的片段，與同樣經(jīng)EcoR?I和Not?I雙酶切的線性表達載體pET-28a+連接，連接體系：目的片段5uL，pET-28a+?載體3uL，T4?DNA?Ligase?1uL，10*buffer?1uL，4℃連接過夜；取10μL連接產(chǎn)物與100μL?BL21感受態(tài)細胞混合，冰浴30min，42℃熱激90s后迅速置冰浴中靜置2min，加入800μL無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃?150?rpm搖床培養(yǎng)45min后，5000rpm離心5min，棄上清，留200uL將菌體吹勻后涂布含kana，100μg/mL的LB平板，37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16h；次日挑取白色單菌落，用含kana的LB培養(yǎng)基小量擴增培養(yǎng)；OMEGA試劑盒小量提取質(zhì)粒；分別經(jīng)PCR鑒定和EcoR?、Not?I雙酶切鑒定，將鑒定陽性的重組質(zhì)粒命名為pET-28-Cap并進行序列測定分析；

3.重組菌的誘導(dǎo)表達

將鑒定為陽性的BL21菌液按1：100的比例轉(zhuǎn)接到含kana的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，OD₆₀₀值為0.6，加入不同終濃度的乳糖分別誘導(dǎo)2h、3h、4h、5h、6h，同時設(shè)未誘導(dǎo)菌液對照和pET-28a/BL21誘導(dǎo)對照；取1mL菌液，13000rpm離心1min后，棄上清，加入50uL?PBS和50uL?2*SDS-PAGE?Loading?Buffer重懸，沸水煮5?min，進行12%SDS-PAGE，結(jié)果顯示，pET-28-cap在30kDa處有一條很濃的蛋白條帶，與預(yù)期目的條帶大小相符；而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌則無此條帶，空載體質(zhì)粒pET-28a+轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)后在約7kDa處出現(xiàn)組氨酸標(biāo)簽蛋白條帶，說明蛋白已經(jīng)得到了表達；