[發(fā)明專(zhuān)利]一種豬II型圓環(huán)病毒ORF2蛋白的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210509316.4
• 申請(qǐng)日: 2012-12-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102994518A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李朝陽(yáng);李明義;石喬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東信得科技股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/34
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/34;C12N15/70;C07K14/01;C07K1/22
• 代理公司: 北京恒都律師事務(wù)所 11395
• 代理人: 邸建凱

1.一種豬II型圓環(huán)病毒ORF2蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1.序列合成

通過(guò)序列比對(duì)，在保證編碼的氨基酸相同的前提下改變核苷酸序列，把序列中的稀有密碼子替換成大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，并在序列兩端分別加上EcoR?I和Not?I?限制性酶切位點(diǎn)，合成cap基因，連接到PES載體上，按照設(shè)定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，將目的片段克隆至pMD18-T質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落，OMEGA試劑盒小量提取質(zhì)粒，酶切鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒；

2．原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將質(zhì)粒pES-Cap經(jīng)EcoR?I和Not?I雙酶切，回收702bp的目的片段，與同樣經(jīng)EcoR?I和Not?I雙酶切的線性表達(dá)載體pET-28a(+)連接，連接體系：目的片段5uL，pET-28a(+)?載體3uL，T4?DNA?Ligase?1uL，10*buffer?1uL，4℃連接過(guò)夜；取10μL連接產(chǎn)物與100μL?BL21感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min，42℃熱激90s后迅速置冰浴中靜置2min，加入800μL無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃?150?rpm搖床培養(yǎng)45min后，5000rpm離心5min，棄上清，留200uL將菌體吹勻后涂布含kana，100μg/mL的LB平板，37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16h；次日挑取白色單菌落，用含kana的LB培養(yǎng)基小量擴(kuò)增培養(yǎng)；OMEGA試劑盒小量提取質(zhì)粒；分別經(jīng)PCR鑒定和EcoR??、Not?I雙酶切鑒定，將鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命名為pET-28-Cap并進(jìn)行序列測(cè)定分析；

3.重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定為陽(yáng)性的BL21菌液按1：100的比例轉(zhuǎn)接到含kana的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，OD₆₀₀值為0.6，加入不同終濃度的乳糖分別誘導(dǎo)2h、3h、4h、5h、6h，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)菌液對(duì)照和pET-28a/BL21誘導(dǎo)對(duì)照；取1mL菌液，13000rpm離心1min后，棄上清，加入50uL?PBS和50uL?2*SDS-PAGE?Loading?Buffer重懸，沸水煮5?min，進(jìn)行12%SDS-PAGE，結(jié)果顯示，pET-28-cap在30kDa處有一條很濃的蛋白條帶，與預(yù)期目的條帶大小相符；而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌則無(wú)此條帶，空載體質(zhì)粒pET-28a(+)轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)后在約7kDa處出現(xiàn)組氨酸標(biāo)簽蛋白條帶，說(shuō)明蛋白已經(jīng)得到了表達(dá)；

4.重組菌的可溶性表達(dá)及蛋白純化

通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)劑濃度等誘導(dǎo)條件的摸索，重組菌在37℃，10g/L?乳糖濃度等誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)表達(dá)6h，蛋白的可溶性表達(dá)量最大；凍融菌體并進(jìn)行超聲破碎30min，設(shè)置為間隔1秒，超聲3秒，離心后收集上清和沉淀；上清和沉淀中的蛋白樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳；對(duì)可溶性的重組蛋白進(jìn)行His-蛋白質(zhì)鎳親和層析。