[發(fā)明專利]一種雞亞單位三聯(lián)疫苗及其制備和應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210506647.2
• 申請(qǐng)日: 2012-12-03
• 公開（公告）號(hào): CN102973935A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王雷;凌紅麗;蔣皓靜;楊光烈
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島康地恩藥業(yè)股份有限公司;青島寶依特生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/295
• 分類號(hào): A61K39/295;A61P31/14;A61K39/12;A61K39/17
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于禽類疫苗制造領(lǐng)域，具體涉及一種雞亞單位三聯(lián)疫苗及其制備和應(yīng)用，即一種雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊病三聯(lián)疫苗。

背景技術(shù)

雞新城疫（newcastle?disease，ND）是由雞新城疫病毒（NDV）引起的禽類急性傳染病，傳播速度快，長(zhǎng)期以來給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的威脅。雞新城疫活疫苗雖然效果好、價(jià)格低廉、使用方便，但其免疫期短、免疫易受母源抗體干擾，且容易引起呼吸道副作用，干擾實(shí)驗(yàn)室診斷病毒分離，因此，1980年以來，使用雞新城疫滅活疫苗逐漸成為我國雞場(chǎng)防治雞新城疫的常規(guī)方法之一。

雞傳染性法氏囊?。↖nfectious?Bursal?Disease，IBD）又稱雞傳染性腔上囊病，是由傳染性法氏囊病毒引起的一種急性、接觸傳染性疾病。以法氏囊發(fā)炎、壞死、萎縮和法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞嚴(yán)重受損為特征，能夠引起雞的免疫機(jī)能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果。該病發(fā)病率高，是目前養(yǎng)禽業(yè)最重要的疾病之一。而且，近年來由于超強(qiáng)毒的出現(xiàn)，傳統(tǒng)的疫苗免疫失敗屢屢發(fā)生，因此，有必要篩選雞傳染性法氏囊病毒的不同等位基因，并借助基因工程亞單位疫苗的方法為雞傳染性法氏囊病預(yù)防提供了一條新的途徑。

雞傳染性支氣管炎（Avian?infectious?bronchitis，IB）是急性接觸性傳染性呼吸道疾病，其特征為病雞咳嗽、噴嚏、氣管啰音，蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和質(zhì)量下降。IB為世界各國集約化養(yǎng)雞普遍存在的疫病，有的地區(qū)陽性率可達(dá)100%。我國主要流行的病原血清型是Massachusetts型，該型毒株異型毒株也能產(chǎn)生較好的免疫力，我國普遍選用M41株做為疫苗毒株。

為了有效控制ND、IB和IBD，減少接種次數(shù)，便于生產(chǎn)應(yīng)用，因此，有必要提供一種雞新城疫、傳染性支氣管炎和傳染性法氏囊病三聯(lián)疫苗來滿足市場(chǎng)的要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是制備一種可以同時(shí)預(yù)防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎和雞傳染性法氏囊病特別是超強(qiáng)毒感染的疫苗，其中的雞傳染性法氏囊病部分是采用大腸桿菌表達(dá)的主要抗原保護(hù)性蛋白VP2蛋白制成的亞單位疫苗。

本發(fā)明的三聯(lián)疫苗由抗原和疫苗輔劑組成，所述的抗原為雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒和序列為SEQ?ID?NO：1的雞傳染性法氏囊病VP2蛋白。??

上述的三聯(lián)疫苗的制備方法，是將新城疫病毒接種雞胚后，收獲胚液加入甲醛滅活；將雞傳染性支氣管炎病毒接種雞胚后，收獲胚液加入甲醛滅活；然后將滅活的新城疫病毒胚液、雞傳染性支氣管炎病毒胚液與雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白混合后，加入疫苗佐劑乳化制成的。

上述的新城疫病毒為新城疫病毒Clone30。

上述的傳染性支氣管炎為傳染性支氣管炎M41。

本發(fā)明三聯(lián)疫苗免疫21日齡的雞，可同時(shí)預(yù)防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎和雞傳染性法氏囊病，免疫效果與雞新城疫單苗、雞傳染性支氣管炎滅活疫苗及雞傳染性法氏囊病單苗效果相似，達(dá)到了減少免疫次數(shù)，降低應(yīng)激的目的。

具體實(shí)施方式

IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2蛋白是最主要宿主保護(hù)性抗原，本發(fā)明是用PCR方法擴(kuò)增了IBD超強(qiáng)毒的VP2基因，克隆到pET-28a載體上，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后VP2蛋白獲得了表達(dá)，將表達(dá)菌體高壓勻漿破碎后離心取上清即為VP2蛋白溶液。

新城疫病毒Clone30株接種10日齡SPF胚，收取培養(yǎng)48~96小時(shí)的雞胚液，超濾濃縮法將病毒液濃縮，加入終濃度為0.1%的甲醛。

雞傳染性支氣管炎病毒M42株接種10~11日齡SPF胚，收取培養(yǎng)24~48小時(shí)的雞胚液，超濾濃縮法將病毒濃縮，加入終濃度為0.1%的甲醛。

將VP2蛋白液與新城疫病毒液、雞傳染性支氣管炎病毒液混合后乳化配苗。

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊病毒VP2亞單位三聯(lián)疫苗進(jìn)行詳細(xì)的描述。

一、新城疫病毒液的制備

將新城疫病毒Clone30株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，用滅菌生理鹽水做適當(dāng)稀釋，經(jīng)尿囊腔接種9~10日齡易感雞胚，每胚0.1ml，接種后密封針孔，直36~37℃繼續(xù)孵育。棄去48小時(shí)前死亡雞胚，此后4~8小時(shí)照蛋一次，死亡胚隨時(shí)取出，直至96小時(shí)全部取出，置2~8℃冷卻12~24小時(shí)。收獲雞胚尿囊液及羊水，棄去血凝價(jià)低于1:128，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。

新城疫病毒液的濃縮