[發(fā)明專利]一種脂肪酶及其重組表達工程菌株

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210497039.X
• 申請日: 2012-11-29
• 公開（公告）號: CN102978181A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設計）人: 黃亦鈞;張青;徐娟;許麗紅;王華明;吳秀秀
• 申請（專利權(quán)）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N1/15;A23K1/165;C12R1/885
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于微生物工程技術(shù)領域，具體涉及一種脂肪酶基因及其重組表達工程菌株。

背景技術(shù)

脂肪酶即三酰基甘油?；饷?，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。?脂肪酶基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈。它的催化活性僅僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（Schmid?等,?1998）。

脂肪酶廣泛的存在于動植物和微生物中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻籽、油菜籽，當油料種子發(fā)芽時，脂肪酶能與其他的酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解油脂類物質(zhì)生成糖類，提供種子生根發(fā)芽所必需的養(yǎng)料和能量；動物體內(nèi)含脂肪酶較多的是高等動物的胰臟和脂肪組織，在腸液中含有少量的脂肪酶，用于補充胰脂肪酶對脂肪消化的不足，在肉食動物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在動物體內(nèi)，各類脂肪酶控制著消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代謝等過程；細菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更為豐富（Pandey等）。由于微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，具有比動植物更廣的作用p?H、作用溫度范圍以及底物專一性，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源，并且在理論研究方面也具有重要的意義。

脂肪酶具有廣泛的應用價值，已成為市場上的第三大工業(yè)用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應，廣泛應用于飼料添加劑、油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)。脂肪酶的制備方法有提取法和微生物發(fā)酵法（王海燕等，2007，飼料工業(yè)）。但是提取法工藝復雜，成本高、效率低。因此，絕大多數(shù)脂肪酶均是通過微生物發(fā)酵而制備的?，F(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)脂肪酶的方法主要有二種：一是誘變選育高產(chǎn)的脂肪酶的自然菌株，如解脂亞羅酵母（李珍等，2011，菌物學報；徐宇麗等，2011，微生物學報）；二是構(gòu)建高產(chǎn)的工程菌（王小峰等，2011，生物工程雜志）。

構(gòu)建基因工程菌是獲得高產(chǎn)、高酶活菌株的有效方法之一。目前國內(nèi)市場上脂肪酶產(chǎn)品多由畢赤酵母異源表達而生產(chǎn)，其優(yōu)點是發(fā)酵工藝成熟；缺點是甲醇誘導存在的安全隱患，還有畢赤酵母表達水平不高，表達水平一般低于7g/l。

木霉最常用的工業(yè)酶生產(chǎn)菌株之一，其中市場上的纖維素酶絕大多數(shù)是由木霉生產(chǎn)的。木霉屬于真核生物，具有翻譯后修飾系統(tǒng)，如內(nèi)含子的剪切和糖基化等，因此可以直接表達真核來源的DNA序列、無需刪除內(nèi)含子序列，簡化了分子操作。木霉規(guī)模化發(fā)酵系統(tǒng)優(yōu)點是：（1）分泌表達，便于發(fā)酵后處理；（2）深層液體發(fā)酵，便于規(guī)?；I(yè)發(fā)酵；（3）高密度發(fā)酵，生產(chǎn)成本低，其最高表達水平可達40g/l。

因此，通過構(gòu)建木霉工程菌，高效重組表達脂肪酶，有望大大降低發(fā)酵成本，從而降低脂肪酶對使用成本，促進脂肪酶在飼料添加劑領域的廣泛應用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種脂肪酶及其重組表達工程菌株，即一種從黑曲霉中篩選的新的脂肪酶，以及用于重組表達該脂肪酶的里氏木霉工程菌，經(jīng)里氏木霉表達后，該酶對胃液、胃蛋白酶和人工腸液的耐受性增強，可將其廣泛用作飼料添加劑，提高飼料利用率。?

本發(fā)明首先提供一種新型的脂肪酶，其特征在于：

（a）其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的脂肪酶；

（b）在（a）中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。

用于編碼上述脂肪酶的基因，其中一種核苷酸序列是SEQ?ID?NO:2。

本發(fā)明另一方面提供了一種里氏木霉工程菌，用于表達上述的脂肪酶。

所述里氏木霉工程菌ZQ-1（Trichoderma?reesei?ZQ-1），已于2012年11月27日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏編號是：CCTCC?NO:M?2012483。

本發(fā)明的脂肪酶作為飼料添加劑的應用。

本發(fā)明的里氏木霉工程菌能高效表達黑曲霉來源的脂肪酶，20L罐發(fā)酵酶活高達20000U/ml，表達水平超過10g/L。經(jīng)里氏木霉宿主細胞的修飾，本發(fā)明的里氏木霉工程菌重組表達的脂肪酶對胃液、胃蛋白酶和人工腸液的耐受性很強，適合作為飼料添加劑使用。

附圖說明

圖1?：本發(fā)明的里氏木霉工程菌發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳檢測分析圖。

圖2?：本發(fā)明重組表達脂肪酶的耐受性實驗。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。

實施例1?黑曲霉脂肪酶基因表達載體的構(gòu)建

1.1?提取黑曲霉總基因組DNA