[發明專利]表達禽網狀內皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201210495385.4
• 申請日: 2012-11-28
• 公開（公告）號: CN102988969A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 王笑梅;高宏雷;祁小樂;高玉龍;秦立廷;王永強
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/14;C12N15/48;C12N15/63
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明涉及一種DNA疫苗及其構建方法和應用，特別涉及一種表達禽網狀內皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其構建方法和應用。本發明屬于生物醫藥領域。

背景技術

網狀內皮組織增生病（reticuloendotheliosis，RE）是由網狀內皮組織增生病病毒（REV）群的反轉錄病毒引起的禽類的病理綜合征，包括急性網狀細胞腫瘤形成、矮小綜合征和淋巴組織與其它組織慢性腫瘤。

REV屬于哺乳動物C型反轉錄病毒屬，基因大小為9.0kb，主要編碼核心蛋白（gag）、酶蛋白（pol）和囊膜蛋白（env）。其中env基因編碼兩種糖蛋白gp90和gp20，gp90為表面蛋白，是病毒的免疫原蛋白，可誘導機體產生中和抗體。RE不僅能引起禽生長遲緩、廢棄淘汰率升高和死亡，還能引起免疫抑制，干擾其它禽病疫苗的免疫效應，引起免疫失敗，并易繼發感染其它禽病，造成巨大的經濟損失，現已引起廣大研究者的高度重視。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種表達禽網狀內皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其構建方法和應用。

為了達到以上目的，本發明采用的技術手段為：

本發明的一種表達禽網狀內皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中含有SEQ?ID?NO.1所示的序列。

在本發明中，優選的，所述的DNA疫苗是通過將SEQ?ID?NO.1所示的序列克隆入pCAGGS表達載體中得到的。

進一步的，本發明還提供了一種表達禽網狀內皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）根據雞偏嗜密碼子將REV?gp90基因進行密碼子優化，優化后的REV?gp90基因序列如SEQ?ID?NO.1所示，在優化后的基因兩端分別設計酶切位點，合成基因；

（2）將合成的基因克隆到pUC19載體中，構建pUC19-optigp90重組質粒；

（3）將pUC19-optigp90重組質粒進行酶切，獲得optigp90基因；

（4）將optigp90基因克隆到用同樣酶酶切后的pCAGGS表達載體中，構建得到pCAGoptigp90重組表達質粒，即為所述的DNA疫苗。

在本發明的一個具體實施例中，步驟（1）中所述的酶切位點為EcoRI、ClaI。

在本發明中，更優選的，所述的構建方法還包括對所述重組表達質粒pCAGoptigp90進行提取純化。

更進一步的，本發明還提供了所述的DNA疫苗在制備治療或預防禽網狀內皮組織增生病藥物中的應用。

與傳統疫苗相比，本發明DNA疫苗既擁有亞單位疫苗和滅活疫苗的安全性，又具有只有弱毒疫苗或重組疫苗才有的同時誘導體液免疫和細胞免疫應答的特點。

附圖說明

圖1為重組質粒pCAGoptigp90PCR和酶切鑒定結果；

圖2為質粒轉染DF-1細胞48h后間接免疫熒光檢測結果；

圖3為質粒轉染DF-1細胞48h后Western?blot檢測結果；

圖4為REV?DNA疫苗pCAGoptigp90免疫后各周雞體內抗體滴度檢測結果。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，絕不限制本發明的保護范圍。

實施列1表達禽網狀內皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗的構建及表達

1材料和方法

1.1病毒株和細胞

REV?HLJR0901株由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所禽免疫抑制病課題組分離鑒定并保存。pUC19載體、pCAGGS載體和DF-1細胞由本實驗室保存，可通過商業途徑購買得到。

1.2儀器與試劑

質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自omega公司；限制性內切酶和T4?DNA連接酶購自Fermentas公司；紫外分光光度計購自GE公司；Lipofectamine?2000轉染試劑購自invitrogen；RIPA裂解液購自碧云天公司；血液基因組提取試劑盒購自Omega公司；REVgp90單克隆抗體、大腸桿菌感受態Top10F’有本實驗室保存。

1.3表達禽網狀內皮組織增增病病毒gp90基因的DNA疫苗的構建步驟：