[發(fā)明專利]增強(qiáng)外源蛋白表達(dá)的增強(qiáng)子樣基因及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210493795.5
• 申請(qǐng)日: 2012-11-28
• 公開（公告）號(hào): CN102965375A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 井申榮;王應(yīng)明;曾韋錕;黃芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種增強(qiáng)外源蛋白表達(dá)的增強(qiáng)子樣基因序列，用于提高外源基因在原核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平。

背景技術(shù)

隨著分子生物學(xué)及基因工程的發(fā)展，外源基因表達(dá)為蛋白表達(dá)系統(tǒng)的開發(fā)提供了廣闊的應(yīng)用前景。目前常用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前研究較為成熟的，但是某些表達(dá)的目的產(chǎn)物仍表達(dá)水平很低；酵母表達(dá)系統(tǒng)也經(jīng)常出現(xiàn)外源基因拷貝數(shù)低；哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，外源基因不能持久表達(dá)，且成本很高，技術(shù)背景復(fù)雜。因此，無論在何種表達(dá)系統(tǒng)中，外源基因表達(dá)水平低都是一個(gè)共有的難題。20世紀(jì)80年代初，首先在真核病毒SV40基因組中發(fā)現(xiàn)了能夠增強(qiáng)蛋白表達(dá)基因序列(Banerji?J?et?aL,CeLL,?1981,?27(2Pt1):?299-308)，此后研究證明這類序列廣泛存在于真核生物及其病毒基因組中，這對(duì)改造蛋白表達(dá)系統(tǒng)提供了一個(gè)新的方向。對(duì)原核生物基因表達(dá)調(diào)控的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)在原核生物基因組也存在類似于真核轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)調(diào)控模式，且某些真核生物DNA片段在原核細(xì)胞中也具有增強(qiáng)子樣功能，這類序列稱為增強(qiáng)子樣序列（enhancer-Like?sequence，ERLS）。目前開發(fā)改進(jìn)的蛋白表達(dá)系統(tǒng)中，通過增加蛋白表達(dá)標(biāo)簽，補(bǔ)充外源基因表達(dá)所需的稀有密碼子以及增加表達(dá)系統(tǒng)中外源基因拷貝數(shù)等方法使用較多，采用增強(qiáng)子樣基因序列改進(jìn)蛋白表達(dá)系統(tǒng)目前使用比較少，且很多未知的調(diào)控基因表達(dá)序列可能尚未被開發(fā)。

增強(qiáng)子（enhancer，ER），在基因表達(dá)調(diào)控中，增強(qiáng)子長(zhǎng)度通常為100~200bp，與啟動(dòng)子、絕緣子及沉默子協(xié)同作用，對(duì)調(diào)控基因的時(shí)空表達(dá)具有重要作用。增強(qiáng)子重要作用特點(diǎn)之一：無方向性，即不論增位于啟動(dòng)子上游或下游，均能激活其相應(yīng)啟動(dòng)子。它的增強(qiáng)活性能體現(xiàn)在基因的表達(dá)水平上，目前已有少數(shù)的增強(qiáng)子樣序列應(yīng)用于提高蛋白表達(dá)水平。基因陷阱（gene?trap）是研究基因與調(diào)節(jié)元件功能的一個(gè)有力工具。目前已成功地應(yīng)用于果蠅、小鼠、擬南芥等重要模式動(dòng)植物的功能基因組研究(O'Brochta?DA?et?aL,?Proc?NatL?Acad?Sci?USA,?2011,?108(39):?16339-16344)，并發(fā)現(xiàn)了大量的新基因。本發(fā)明增強(qiáng)子樣基因序列的篩選方法即采用了融合報(bào)告基因和基因陷阱的思路，增強(qiáng)子樣序列誘捕載體以人乳頭瘤病毒（Human?PapiLLomavirus,HPV）58型主要衣殼蛋白L1基因和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT）融合表達(dá)作為報(bào)告基因，在增強(qiáng)子樣序列插入時(shí)，菌株的氯霉素抗性提高，因而通過增加氯霉素濃度達(dá)到大規(guī)模篩選以獲得相應(yīng)的增強(qiáng)基因表達(dá)的序列。

目前發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)子樣序列（enhancer-Like?sequence，ERLS）主要應(yīng)用在增強(qiáng)低分子量蛋白表達(dá)，例如干擾素，白細(xì)胞介素，本發(fā)明的報(bào)告基因需要表達(dá)較大融合蛋白基因（85KD），利用該融合基因篩選的序列也可構(gòu)建一種高分子量蛋白表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)而解決一些高分子量基因在外源表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)率低的難題。大腸桿菌是重要基因工程菌，遺傳背景清楚，操作簡(jiǎn)便、快速且成本低廉，成為篩選表達(dá)外源基因原核增強(qiáng)子樣序列的首選。

因此，本發(fā)明將病毒衣殼蛋白與抗生素基因連接形成融合表達(dá)報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)外源基因表達(dá)的增強(qiáng)子樣基因序列ER1，可作為改善異源基因原核表達(dá)系統(tǒng)方面具有重要實(shí)用價(jià)值一種工具。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種增強(qiáng)外源蛋白表達(dá)的增強(qiáng)子樣基因，旨在改進(jìn)外源基因原核表達(dá)系統(tǒng)，該增強(qiáng)子樣基因序列具有如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列或其截短序列。

本發(fā)明中所述增強(qiáng)子樣基因截短序列為增強(qiáng)子樣基因ER1任一長(zhǎng)度的序列，如實(shí)施例7即為其截短序列，核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1第99~516bp所示。

本發(fā)明首先抽提細(xì)菌基因組樣品，細(xì)菌基因組源于昆明市呈貢區(qū)居民生活污水樣品和昆明市第四十三解放軍總醫(yī)院附近污水處理廠污水樣品中的細(xì)菌經(jīng)富集抽提獲得。基因組經(jīng)酶切500bp以下DNA片段，并由此構(gòu)建到增強(qiáng)子樣序列篩選重組載體L1-CAT-pET21a啟動(dòng)子上游，構(gòu)建基因文庫，通過氯霉素抗性融合報(bào)告基因篩選含增強(qiáng)子樣序列的菌株，之后，對(duì)菌株抗氯霉素抗性和增強(qiáng)子樣序列進(jìn)行了來源分析及其增強(qiáng)外源蛋白表達(dá)的能力進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的：

（1）????構(gòu)建含融合報(bào)告基因的重組篩選菌株