[發(fā)明專利]一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗及其構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210489364.1
• 申請(qǐng)日: 2012-11-26
• 公開（公告）號(hào): CN102935240A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉光清;程英杰;孟春春;陳宗艷;李傳峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K39/12;A61P31/14;C12N15/40;C12N15/86;C12N15/66
• 代理公司: 上海漢聲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)與動(dòng)物傳染病學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

兔出血癥病毒(Rabbit?hemorrhagic?disease，RHD)俗稱“兔瘟”，是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種急性高致死性兔傳染病。本病具有病死率高、死亡快，而且傳播迅速等特點(diǎn)，對(duì)養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅，因而被國(guó)際獸疫局正式列為“國(guó)際動(dòng)物保健編目”B類傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將之列為二類動(dòng)物疫病。1984年初，劉勝江等在我國(guó)江蘇無錫首次發(fā)現(xiàn)兔瘟以后，本病迅即蔓延到我國(guó)25省市、自治區(qū)，其后，世界各地如墨西哥及歐洲的許多國(guó)家也有類似兔瘟流行，給養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。

RHDV的衣殼蛋白為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，稱VP60。該蛋白是RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，VP60構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)衣殼由180個(gè)完全相同的亞基組成，亞基之間相互作用然后形成具有三維構(gòu)象的衣殼。該組裝過程與各個(gè)亞基的N端序列有關(guān)，因?yàn)閷⒃搮^(qū)段缺失后，VP60就再不能裝配成空衣殼。RHDV在宿主細(xì)胞中完成一個(gè)復(fù)制周期后，由VP60組裝的空衣殼將子代RNA包裹形成成熟的病毒粒，然后隨著細(xì)胞的裂解釋放出來，侵染其它的敏感細(xì)胞。大量研究結(jié)果證明RHDV的衣殼蛋白與病毒的致病性和免疫原性密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)外的學(xué)者使用不同的表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了VP60，用表達(dá)產(chǎn)物接種兔子可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，并能對(duì)抗RHDV的攻擊。

兔出血癥病毒尚未建立體外組織細(xì)胞的培養(yǎng)方法，目前使用的疫苗主要為組織滅活苗。但隨著家兔飼養(yǎng)成本的提高以及非免疫兔的減少，可用于制苗的肝組織日趨減少，使組織滅活苗的成本偏高，加之組織滅活苗可能導(dǎo)致散毒的缺點(diǎn)，近年來人們著眼于兔瘟新型疫苗的研究。

Berglund等(Berglund?P，Smerdou?C，F(xiàn)leeton?MN，et?al.Enhancing?immune?responses?usingsuicidal?DNAvaccines.Nat?Biotech，1998；16：562-565)于1998年率先提出了以甲病毒復(fù)制子為基礎(chǔ)的“自殺性”DNA疫苗(suicidal?DNAvaccine)的設(shè)想，即利用“自殺性”DNA疫苗的甲病毒進(jìn)入細(xì)胞后能表達(dá)出甲病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(nSPs)，在nSPs的作用下甲病毒基因組RNA進(jìn)行高效復(fù)制，在此過程中產(chǎn)生大量的雙鏈RNA(dsRNA)中間體，最終可使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡，基于甲病毒復(fù)制子的DNA疫苗可引起轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡，也稱“自殺性”DNA疫苗，它比傳統(tǒng)DNA疫苗更安全，無整合到宿主染色體的潛在危險(xiǎn)性。自殺性DNA疫苗可引起高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫，且可打破免疫耐受。在甲病毒基因組高效復(fù)制同時(shí)，目的抗原在亞基因組啟動(dòng)子的調(diào)控下獲得高效表達(dá)，從而可以較低的免疫劑量引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。

自殺性DNA疫苗的載體是以甲病毒復(fù)制子為基礎(chǔ)的復(fù)制型DNA載體。病毒復(fù)制時(shí)結(jié)構(gòu)基因拷貝數(shù)高達(dá)10⁵之多，因此可以利用亞基因組的啟動(dòng)子使外源基因獲得高效表達(dá)。自殺性DNA疫苗由于其具有RNA復(fù)制子，大量復(fù)制可導(dǎo)致感染細(xì)胞的凋亡。該凋亡可能是復(fù)制型載體在表達(dá)外源基因的過程中產(chǎn)生雙鏈RNA(dsRNA)復(fù)制中間體介入的結(jié)果。dsRNA能在細(xì)胞和體液免疫中起強(qiáng)大的輔助作用。后來，研究者將RNA復(fù)制子載體系統(tǒng)改造成以DNA為基礎(chǔ)的、RNA聚合酶依賴的系統(tǒng)。這種載體攜帶了甲病毒復(fù)制酶基因和外源基因的重組質(zhì)粒DNA，缺失了病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因。它通過將人巨細(xì)胞病毒(CMV)早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子序列插入到SP6啟動(dòng)子的上游或替換SP6啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，在多克隆位點(diǎn)下游插入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)SV40晚期聚A信號(hào)序列，正常終止轉(zhuǎn)錄。該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，利用宿主RNA聚合酶n在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，合成甲病毒復(fù)制酶，再合成亞基因組RNA及大量外源蛋白，從而大大提高表達(dá)效率。因此，從自殺性DNA疫苗的構(gòu)建上我們可以看出其具有RNA疫苗和DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)，能自主復(fù)制、大量表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗，以解決現(xiàn)有技術(shù)中現(xiàn)有的RHDV疫苗一般為弱毒苗或滅活苗，弱毒苗存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，而滅活苗往往需要多次免疫接種，而且效果不穩(wěn)定，還經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗的技術(shù)問題。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：