[發(fā)明專利]一種豬Ⅱ型細環(huán)病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表達及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210486627.3
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN103014056A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李中圣;陳軼雯;賴芳芳;趙焱
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東現(xiàn)代農(nóng)業(yè)集團研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;G01N33/68;G01N33/543;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/84
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)哲力專利商標事務(wù)所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及獸藥領(lǐng)域，具體涉及一種豬Ⅱ型細環(huán)病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表達及應(yīng)用。

背景技術(shù)

輸血傳播病毒（Transufson?Transmitted?Viurs，TTV）是一類無囊膜，二十面體，單股負鏈環(huán)狀DNA病毒，電鏡觀察病毒顆粒直徑約為30-32nm。TTV首次由日本學(xué)者從一例未知病原的非甲-非戊型輸血后肝炎病人的血清中發(fā)現(xiàn)，隨后人們在非靈長類以及豬、牛、羊、犬，貓、家禽等多種家養(yǎng)及野生動物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了TTV的感染。2009年，國際病毒分類協(xié)會（ICTV）將豬的TTV劃分到指環(huán)病毒科（Anelloviridae）細環(huán)病毒屬（Iotatorquevirus），并進一步劃分為兩個種:豬Ⅰ型細環(huán)病毒（Torque?teno?sus?virus?Ⅰ：TTSuV1)和豬Ⅱ型細環(huán)病毒（Torque?teno?sus?virus?Ⅱ：TTSuV2)。作為一種較為新型的病毒，TTSuV2的致病機理知之甚少。2004年，McKeown對中國，愛荷華州，泰國，安大略，韓國，西班牙，魁北克和薩斯喀徹溫省這六個不同國家地區(qū)的154份豬血清進行檢測，TTSuV2陽性率可高達66.2%(102/154)。Aramouni等證實了TTSuV2與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)之間有一定的聯(lián)系并發(fā)現(xiàn)TTSuV2與其他已知的豬病原體協(xié)同感染可以導(dǎo)致疾病加重。近年來，關(guān)于TTSuV2和TTSuV2的報道逐漸增多，TTSuV2的感染具有廣泛性和普遍性，這一特點引起了諸多科研工作者的關(guān)注。因此，加強對TTSuV2的流行病學(xué)調(diào)查，確定其抗原性位點，對TTSuV2的防治有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種豬Ⅱ型細環(huán)病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表達，獲得酵母表達的TTSuV2-ORF1截短蛋白作為包被抗原在用于TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒中，提高試劑盒的特異性、重復(fù)性及穩(wěn)定性。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種酵母表達的TTSuV2-ORF1截短蛋白在TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒，采用本發(fā)明的酵母表達的TTSuV2-ORF1截短蛋白作為包被抗原，以獲得具有良好特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性的TTSuV2抗體診斷試劑盒。

本發(fā)明的目的之四在于提供一種酵母表達的TTSuV2-ORF1截短蛋白在豬Ⅱ型細環(huán)病毒亞單位疫苗中的應(yīng)用。

為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

豬Ⅱ型細環(huán)病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表達，其包括以下步驟：

1）TTSuV2?ORF1待表達片段的選擇:以TTSuV2陽性樣品的核酸為模板，在病毒基因序列的保守區(qū)設(shè)計引物SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2，應(yīng)用LATaqDNA聚合酶擴增目的片段；對擴增產(chǎn)物進行電泳，切下目的條帶，利用OMEGA膠回收試劑盒回收DNA，對純化的片段進行測序，使用ClustalX軟件包對測序結(jié)果進行序列匹配和多重序列比對，獲取TTSuV2?ORF1序列SEQ?IDNO:3；

2）TTSuV2?ORF1’片段的選擇：應(yīng)用ProtScale氨基酸分析軟件在上述的TTSuV2?ORF1序列SEQ?ID?NO:3中選出預(yù)測抗原性較強且抗原區(qū)較為集中的TTSuV2?ORF1’序列為SEQ?ID?NO:4的蛋白片段；

3）TTSuV2?ORF1’的酵母表達：構(gòu)建插入TTSuV2?ORF1’的pPICZαA重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化P．pastoris?X‐33酵母菌，篩選重組TTSuV2?ORF1’的高拷貝子，獲取真核表達的TTSuV2?ORF1’目的蛋白片段；

4）TTSuV2?ORF1’目的蛋白片段的鑒定與純化：篩選出的高拷貝子，用50%硫酸銨沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，應(yīng)用親和層析的方法純化重組TTSuV2?ORF1’，在PBS中透析后，應(yīng)用BCA法進行定量，純化后獲得酵母表達的TTSuV2-ORF1截短蛋白。

本發(fā)明中，步驟1）應(yīng)用LA?TaqDNA聚合酶擴增目的片段的反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s,共30個循環(huán)；72℃延伸8min；反應(yīng)完成后用1.0%的瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳。