[發明專利]一種豬Ⅱ型細環病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表達及應用

有效

• 申請號: 201210486627.3
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN103014056A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 李中圣;陳軼雯;賴芳芳;趙焱
• 申請（專利權）人: 廣東現代農業集團研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;G01N33/68;G01N33/543;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/84
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

1.一種豬Ⅱ型細環病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表達，其特征在于其包括以下步驟：

1）TTSuV2?ORF1待表達片段的選擇:?以TTSuV2陽性樣品的核酸為模板，在病毒基因序列的保守區設計引物SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2，應用LA?TaqDNA?聚合酶擴增目的片段；對擴增產物進行電泳，切下目的條帶，利用OMEGA?膠回收試劑盒回收DNA，對純化的片段進行測序，使用Clustal?X軟件包對測序結果進行序列匹配和多重序列比對，獲取TTSuV2?ORF1序列SEQ?ID?NO:3；

2）TTSuV2?ORF1’片段的選擇：應用ProtScale氨基酸分析軟件在上述的TTSuV2?ORF1序列SEQ?ID?NO:3中選出預測抗原性較強且抗原區較為集中的TTSuV2?ORF1’序列為SEQ?ID?NO:4的蛋白片段；

3）TTSuV2?ORF1’的酵母表達：構建插入TTSuV2?ORF1’的pPICZαA重組質粒，電轉化P．pastoris?X-33酵母菌，篩選重組TTSuV2?ORF1’的高拷貝子，獲取真核表達的TTSuV2?ORF1’目的蛋白片段；

4）TTSuV2?ORF1’目的蛋白片段的鑒定與純化：篩選出的高拷貝子，用50%硫酸銨沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，應用親和層析的方法純化重組TTSuV2?ORF1’，在PBS中透析后，應用BCA法進行定量，純化后獲得酵母表達的TTSuV2-ORF1截短蛋白。

2.根據權利要求1所述的豬Ⅱ型細環病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表達，其特征在于：步驟1）應用LA?TaqDNA聚合酶擴增目的片段的反應程序為94℃預變性5min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s,?共30個循環；72℃延伸8?min；反應完成后用1.0%的瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳。

3.根據權利要求1所述的豬Ⅱ型細環病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表達，其特征在于：步驟3）的具體過程為：應用Primer?Premier5.0設計引物SEQ?ID?NO:5和引物SEQ?ID?NO:6，以TTSuV2陽性核酸為模板，應用Kod?plus高保真酶的PCR擴增反應獲得目的條帶，電泳、純化目的條帶；雙酶切PCR產物及載體pPICZαA，連接，轉化E.?coli：DH5α后測序驗證載體正確性，提取構建正確的重組質粒pPICZα‐TTSuV2?ORF1’，Sac?I單酶切線性化；將酵母菌X‐33制備成感受態細胞，取出80μl感受態細胞與5～10μg線性化的重組表達質粒混合，轉入0.2?cm電轉杯，電轉化，將菌液用1?ml冰浴山梨醇l0倍稀釋后，涂布于基本葡萄糖培養基選擇平板上，置于30℃培養2～3d，在200-1000μg/ml濃度段的Zeocin的YPD平板上篩選具有1000μg/ml?Zeocin抗性且生長良好的菌株作為表達株，接種單菌落于25?ml?BMGY培養基，于30℃培養至OD_600nm?4.0，離心、收集菌體，用100?ml?BMMY培養基重懸培養，每日取樣1ml，并補加純甲醇于培養基至終濃度為0.5％，誘導表達5d，取樣品離心收集上清作SDS?-PAGE分析，以Anti?-HIS?-antibody為第一抗體，Western?Blotting獲得真核表達的TTSuV2?ORF1’目的蛋白片段。

4.根據權利要求3所述的豬Ⅱ型細環病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表達，其特征在于：所述Kod?plus高保真酶的PCR擴增反應程序為94℃預變性?5min；94℃變性30s，52℃退火30s，68℃延伸40s,?設置30個循環；68℃延伸8min。

5.權利要求1所述的酵母表達的TTSuV2-ORF1截短蛋白作為包被抗原在TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒中的應用。

6.一種TTSuV2?抗體間接ELISA?診斷試劑盒，其特征在于：其包括用權利要求1所述的酵母表達的TTSuV2-ORF1截短蛋白包被抗原包被的酶標板，100μl?TTSuV2陽性對照血清，100μl?TTSuV2陰性對照血清，100μl?HRP標記兔抗豬二抗，100μl抗體稀釋液、100μl顯色液、100μl終止液以及洗脫液。