[發明專利]一種有效提高苦蕎麥總黃酮含量的組培方法

有效

• 申請號: 201210473206.7
• 申請日: 2012-11-20
• 公開（公告）號: CN102960246A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 王躍華;趙鋼;宋超;孫雁霞;段有麗;陳麗;鄔曉勇;吳佳靚;覃澤嬌;王朝君;熊云翔
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 成都科奧專利事務所(普通合伙) 51101
• 代理人: 王蔚

技術領域

本發明涉及一種蕎麥的組織培養方法，特別是涉及一種可有效提高蕎麥總黃酮含量的組培方法。?

背景技術

蕎麥是一種藥食同源的植物，有苦蕎和甜蕎兩種。由于苦蕎麥其籽粒、根、莖、葉及花等多種器官中都含有大量黃酮類物質，因而被譽為“降血糖、降血壓、降血脂”的三降食品。隨著其營養價值和藥用價值的不斷發現，苦蕎麥植物資源越來越受到人們的青睞。但由于苦蕎麥植物具有自花授粉的特點，因而導致其在農業生產育種上存在人工雜交難以成功，這也是當前苦蕎麥在育種方面難以獲得高產優良品種的重要原因。組織培養可在一定程度上解決苦養麥在育種上所遇到的問題。目前已有以苦蕎麥莖段、葉片、葉柄為外植體培養其愈傷組織的報道。?

大量研究表明，在植物細胞的懸浮培養過程中，通過加入最終目的化合物的前體物，可以大大提高懸浮培養細胞的次生代謝物含量。目前還未見采用前體飼喂技術來顯著提高苦蕎麥組培物中總黃酮含量的報道。?

發明內容

本發明的目的在于一種有效提高苦蕎麥總黃酮含量的組培方法，該方法通過在蕎麥細胞的液體培養中添加特定的前體物來有效提高蕎麥培養物中的總黃酮含量。?

為達到上述目的，本發明采用的解決方案包括如下步驟：?

(1)?外植體的處理：選取生長健康和無病蟲害的苦蕎莖段作為外植體，?并進行消毒處理；?

?(2)?愈傷組織的誘導培養：取消毒后的外植體，吸干表面的水分后切成0.5cm～1.5cm的長度，然后接入愈傷組織誘導培養基MS+6-BA?0.1～2.0mgL+2，4-D?1～6mgL+IAA?0～1mgL+蔗糖20～60?gL^-1+瓊脂5.0～7.0?g·L^-1中進行培養，培養條件為pH值5.5～6.8、每天光照8～16小時、光照強度1000～2000?lx、培養溫度18～28℃；?

?(3)?愈傷組織的懸浮培養：切取生長15～25天的愈傷組織，以10～50?g·L^-1的接種量接入到添加有前體飼喂物的液體培養基MS+6-BA1.0～2.0mgL^-1+NAA0.1～0.5?mgL^-1+蔗糖20～60?gL^-1+Vc?100～300?mg?L^-1中進行懸浮培養，培養條件為pH值5.5～6.5，培養溫度18～24°C、每天光照8～12小時、光照強度600～1000?lx，搖床轉速為120～140r/min，所述前體飼喂物為乙酸鈉或酵母提取物，乙酸鈉的加入量為1～10?mgL，酵母提取物的加入量為0.5～5gL。?

將上述懸浮培養25天后的愈傷組織細胞從培養液中濾出，用干燥濾紙拭干材料表面水分后，稱取重量，即為鮮重；生物量增殖倍數=（收獲量鮮重—接種量鮮重）/接種量鮮重。?

將上述培養的蕎麥愈傷組織細胞置于55℃的烘箱中烘干至恒重，并用分光光度法對蕎麥組培物中黃酮含量進行檢測，測定樣品通過顯色后在?500nm處直接測定吸光度，并計算出組培物中黃酮的含量。?

上述步驟（1）中所述消毒處理是指將苦蕎莖段用濃度為0.1%的升汞消毒3～8分鐘，再用無菌水清洗3～5次。?

上述步驟（1）中的苦蕎莖段選用靠近苦蕎麥植株頂芽端的幼嫩莖段。?

上述步驟（3）中的愈傷組織選擇生長旺盛、質地較疏松且無褐變產生的愈傷組織。?

本發明是具有這樣一個思路：由于黃酮的生物合成包含乙酸丙二酸途?徑和莽草酸途徑，而黃酮的A環是乙酸經乙酸丙二酸途徑合成，因此，喂飼前體物乙酸鈉是合成黃酮的直接前體，因而添加適宜濃度的乙酸鈉，可以明顯地提高蕎麥懸浮培養細胞中次生代謝產物黃酮的合成。而飼喂的前體物酵母提取物，作為一種生物性誘導劑可通過活化苯丙烷類途徑中的一系列關鍵酶，如苯丙氨酸解氨酶?(?PAL?)、?肉桂酸?4-羥化酶?(CA4H)和香豆酸-?CoA聯結酶?(4CL)等能促使黃酮類化合物的積累。?

因此本發明采用前體飼喂技術，通過在苦蕎麥莖段細胞的懸浮培養液中，添加乙酸鈉或酵母提取物等黃酮合成類物質的代謝中間產物可有效提高苦蕎麥培養細胞中的總黃酮含量，為進一步大規模開展蕎麥植物次生代謝產物的生產奠定了基礎，也為進一步研究蕎麥植物中黃酮次生代謝的分子調控提供了重要的技術支持。?

具體實施方式

實施例1?

(1)?外植體的處理：選取生長健康和無病蟲害的靠近苦蕎植株頂芽端的第1～2個幼嫩莖段作為外植體，用濃度為0.1%的升汞消毒4分鐘，再用無菌水清洗4次；?