[發(fā)明專(zhuān)利]天然麝香的多肽電泳圖譜檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210470177.9
• 申請(qǐng)日: 2012-11-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103076382A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘杰;黃進(jìn)明;于娟;洪緋;袁慧君
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N27/447
• 分類(lèi)號(hào): G01N27/447
• 代理公司: 北京太兆天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11108
• 代理人: 張韜

1.一種天然麝香的多肽電泳圖譜檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

A、天然麝香凝膠電泳分析樣品的制備

稱(chēng)取天然麝香樣品0.003~0.008重量份，加入1體積份乙醚，超聲提取15~25min，離心去上清，揮干乙醚，不溶物加0.05體積份電泳上樣緩沖液（1X），超聲提取15~25min，在4500rpm，10℃條件下離心15~25min，取上清，加0.02%溴酚藍(lán)，沸水浴3~8min，即得電泳樣品；

B、Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析方法

（1）電泳溶液準(zhǔn)備：

(a)去離子水溶解100~150重量份Tris，用HCl調(diào)PH值至7-9，定容至500體積份，制得正極緩沖液（10×）；

(b)去離子水溶解50~70重量份Tris，80~100重量份Tricine，3~8重量份SDS，定容至500體積份，制得負(fù)極緩沖液（10×）；

(c)去離子水溶解150~200重量份Tris，1~2重量份SDS，用HCl調(diào)PH值至7~9，定容至500體積份，制得凝膠緩沖液（3×）；

(d)40~60%丙烯酰胺，1~2%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得3C丙烯酰胺儲(chǔ)液；

(e)40~60%丙烯酰胺，1~5%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得6C丙烯酰胺儲(chǔ)液；

(f)0.2~1體積份1mol/L，PH為6.8的Tris-HCl，2~4體積份甘油，1~3體積份10%SDS，0.6~1體積份β巰基乙醇，0.5~1.5體積份1%溴酚藍(lán)，加蒸餾水補(bǔ)足10體積份，制得上樣緩沖液(6×)；

(g)0.2~1體積份1mol/L，PH為6.8的Tris-HCl，2~4體積份甘油，1~3體積份10%SDS，0.6~1體積份β-巰基乙醇，加蒸餾水補(bǔ)足60體積份，制得上樣緩沖液(1×)；

（2）凝膠制備：

分離膠3體積份：取上述制得的凝膠緩沖液(3×)1體積份，0.2~0.6重量份甘油，0.5~1.5體積份6C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至2~4體積份，臨用時(shí)加入0.005~0.02體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0005~0.002體積份TEMED；

夾層膠3體積份：取上述制得的凝膠緩沖液(3×)0.5~1.5體積份，0.5~0.8體積份3C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至2~4體積份,臨用時(shí)加入0.005~0.02體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0005~0.002體積份TEMED；

濃縮膠2體積份：0.4~0.6體積份凝膠緩沖液(3×)，0.1~0.2體積份3C儲(chǔ)液，去離子水稀釋至1~3體積份，臨用時(shí)加入0.005~0.02體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0005~0.002體積份TEMED；

（3）電泳條件：120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)距凝膠底部1cm處

（4）染色方法

采用靈敏度高的銀染，以下溶液臨用前配制：

固定液：量取甲醇30-60體積份，冰醋酸5-20體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份；

染色液：稱(chēng)取0.5~1.0重量份AgNO₃溶于3~5體積份雙蒸水中；取潔凈燒杯，加入0.36%NaOH?15~30體積份，再加入氨水1~2體積份混勻，將制備好的AgNO₃溶液逐滴加入，邊加邊攪拌，全部加入后，加雙蒸水至100體積份；

顯色液：0.3~0.8體積份1﹪檸檬酸，0.03~0.08體積份甲醛，加雙蒸水至100體積份；

終止液：量取冰醋酸1體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份；

C、具體染色步驟：

(a)電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移至固定液中固定0.5~1.5h，每10~30min換一次液；

(b)棄去固定液，凝膠以雙蒸水中漂洗3次，每次5~15min；

(c)將膠移入一個(gè)干凈的容器內(nèi)，染色液中輕搖染色10~20min；

(d)棄去染色液，加雙蒸水震蕩漂洗2~4min；

(e)將膠移至顯色液中輕搖顯色，至色帶清晰，棄去顯色液；

(f)將膠轉(zhuǎn)移至終止液終止染色；

(g)在蒸餾水中漂洗凝膠0.5~1.5h；

(h)進(jìn)行凝膠掃描或?qū)⒛z進(jìn)行干膠保存;

從電泳圖譜可以看出，天然麝香電泳圖譜中具有分子量為74kDa、67kDa的蛋白染色條帶。