[發明專利]制備豬鏈球菌GZ0565株無痕缺失突變株的方法

有效

• 申請號: 201210467416.5
• 申請日: 2012-11-19
• 公開（公告）號: CN102925473A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 吳宗福;邵靚;琚存祥;王衛雪;唐敏;陸承平
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12R1/46
• 代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙) 32238
• 代理人: 張立榮

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及制備豬鏈球菌GZ0565株無痕缺失突變株的方法。

背景技術

豬鏈球菌（Streptococcus?suis）是一種革蘭氏陽性菌，在全世界廣泛分布，可以引起豬的急性敗血癥、腦膜炎、關節炎及急性死亡，也可導致生豬從業人員感染和死亡。國內外對豬鏈球菌毒力因子及致病機理進行廣泛而深入研究?；蛉笔茄芯炕蚬δ?、闡明致病機理的重要手段。目前，現有技術中豬鏈球菌缺失株留有抗性基因。抗性基因的存在有可能影響缺失株的特性，并有潛在的生物安全隱患。理想的缺失應該是無痕的，最終無抗性基因。它有以下優點：首先，它沒有抗性基因的殘留；其次,?可在無痕缺失的基礎上，構建雙缺失，甚至更多缺失；第三，可用無痕缺失技術進行定點突變，這有利于蛋白功能的研究；第四，由于無痕缺失株沒有抗性基因，具有成為疫苗株的潛能。傳統方法在制備豬鏈球菌缺失株的過程中，需要構建含有抗性基因（如氯霉素基因）的質粒，通過直接挑選獲得雙交換的缺失株。這種方法的缺點在于最終的缺失株含有抗性基因（如氯霉素基因），而且直接挑選雙交換的缺失株效率很低。

發明內容

為了解決現有技術中基因缺失豬鏈球菌含有抗性基因及篩選基因缺失豬鏈球菌工作量過大等問題，本發明提供了一種制備豬鏈球菌GZ0565株無痕缺失突變株的方法。

本發明的目的采用如下技術方案實現。

制備豬鏈球菌GZ0565株無痕缺失突變株的方法，包括如下步驟：采用融合PCR方法，得到由待敲除靶基因上下游片段組成的同源重組片段；將同源重組片段插入pSET4S質粒，然后電轉化至豬鏈球菌GZ0565株的感受態細胞進行同源重組，篩選豬鏈球菌GZ0565株無痕缺失突變株。

所述同源重組包括第一次同源重組和第二次同源重組；所述第一次同源重組的具體方法為：將電轉化后的豬鏈球菌GZ0565株感受態細胞在添加有壯觀霉素的THB培養基、37℃條件下培養，進行第一次同源重組，獲得第一重組子；所述第二次同源重組的具體方法為：將第一重組子在THB培養基、28℃條件下培養，進行第二次同源重組，獲得第二重組子。

所述篩選豬鏈球菌GZ0565株無痕缺失突變株的方法為：以第二重組子的基因組DNA為模板，能夠擴增出同源重組片段的菌株即為豬鏈球菌GZ0565株無痕缺失突變株。

在37℃條件下，所述第一重組子能夠在THB培養基和含有壯觀霉素的THB培養基上生長繁殖，所述第二重組子能在THB培養基上生長繁殖、不能在含有壯觀霉素的THB培養基上生長繁殖。

待敲除靶基因為LysM基因時，獲得同源重組片段的方法為：以豬鏈球菌GZ0565基因組DNA為模板，用引物LysM-A和LysM-B擴增LysM基因的上游片段，得到擴增片段1；用引物LysM-C和LysM-D擴增LysM基因下游片段，得到擴增片段2；以擴增片段1和擴增片段2為模板，用引物LysM-A和LysM-D，融合擴增同源重組片段；其中

LysM-A的序列為?：5’-?ctgatcGTCGACAAATTAGCTCCGACAGGTGT?-3’，

?LysM-B的序列為?：5’-?GCCTTCAACCGTTCTTTTAAAT?-3’，

?LysM-C的序列為：?5’-ATTTAAAAGAACGGTTGAAGGCACTTACAAAAATAACCGTTTCA?-3’，

?LysM-D的序列為：?5’-?gagtcaGAATTCGGCCCAATCTTTACCTTCTATC?-3’。

有益效果

本發明提供的制備豬鏈球菌GZ0565株無痕缺失突變株的方法，通過兩次單交換達到雙交換目的，所以大大減少了篩選工作量，提高了篩選效率。另外，該方法得到的豬鏈球菌GZ0565株無痕缺失突變株，敲除了靶基因基因，但是不含有抗性基因，因此具有成為疫苗株的潛能。采用本發明方法，可以在無痕缺失的基礎上，構建雙缺失，甚至更多缺失或者進行定點突變以研究蛋白功能。

附圖說明

圖1是本發明的原理圖。其中SPC是指壯觀霉素抗性基因。

圖2融合PCR擴增產物電泳圖，其中泳道1為DL5000?marker;?泳道2?為?片斷AB;?泳道3?片斷CD;?泳道4為同源重組片斷AD。

圖3?重組質粒LysM-AD-T的鑒定電泳圖，其中泳道1?為?DL5000?marker;?泳道2和3?為重組質粒LysM-AD-T擴增產物。