[發(fā)明專利]BCL10基因突變的快速檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210462251.2
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102965437A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王明;范少安
• 申請（專利權(quán)）人: 上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海唯源專利代理有限公司 31229
• 代理人: 王建國

1.一種BCL10基因突變的快速檢測方法，其特征在于，其包括如下實現(xiàn)步驟：?

設(shè)計一對引物將包括待突變位點在內(nèi)的基因序列擴增出來作為野生型模板;?

再設(shè)計引物在將待突變位點改變成所需堿基的同時，將上述DNA片段在待突變點分為兩段，且在待突變位點附近有少量重復(fù)序列；?

最后利用部分重復(fù)的DNA片段混合起來作為模板，而利用最開始的那對引物將兩個小片段連接起來，其產(chǎn)物即含有所述的突變點；?

不同比例混合上述兩種片段，用HRM方法進行區(qū)分。?

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述PCR產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR產(chǎn)物的Tm取決于GC含量。?

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述純合子包括野生型純合子或突變純合子樣品的擴增產(chǎn)物進行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；雜合子樣品的擴增產(chǎn)物進行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線。?

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種BCL10基因突變的快速檢測方法，其特征在于，其包括如下步驟：?

樣本處理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4℃保存；DNA提取：取200μL抗凝血用試劑盒提取DNA，采用電泳凝膠成像對DNA純度和濃度作檢測；?

qPCR-HRM檢測，包括：?

結(jié)果分析及判定：通過HRM方法，以陽性對照孔為分界線，樣本孔與基線差異大于陽性對照孔的判定為突變型，差異小于陽性對照孔的判定為野生型。?

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述qPCR-HRM檢測的程序包括：95℃變性10分鐘；95℃變性10秒鐘；退火采用探底式，設(shè)置探底退火溫度為55-65℃，每個循環(huán)降低1℃，時間為10秒鐘；72℃延伸30秒鐘；重復(fù)第2步到第四步45個循環(huán);95℃變性60秒鐘；40℃變性60秒鐘；設(shè)置高分辨率熔解溫度從60℃到95℃，緩變率是0.05℃/s）。?

6.根據(jù)權(quán)利要求1或4任一所述的方法，其特征在于:所述野生型目的片段的獲取以已知未突變基因組為模板，BCL2F和BCL2R為引物進行實驗，獲得條帶單一的特異性野生型目的片段；將目的片段稀釋至1萬-10萬倍，終濃度約為10-20ng/μL，作為檢測野生型陰性對照模板用。?

7.根據(jù)權(quán)利要求1或4任一所述的方法，其特征在于：所述BCL10-2突變型目的片段的獲取:突變型目的片段的獲取分為兩步，第一步利用帶有突變位點的突變引物獲得突變位點前后兩段突變片段；第二步將這兩段突變片段連接起來，構(gòu)成BCL10-2突變型目的片段。?

8.根據(jù)權(quán)利要求1或4任一所述的方法，其特征在于：所述M/W＝1％陽性對照模板的獲?。夯旌?9μL野生型模板和1μL突變型模板，配制100μL突變型/野生型（M/W)=1％的混合模板，作為檢測用1％陽性對照模板。?