[發明專利]利用免疫層疊法進行可溶性靶物質的檢測方法

有效

• 申請號: 201210461942.0
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102914643A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 李方和;李時君
• 申請（專利權）人: 李方和
• 主分類號: G01N33/538
• 分類號: G01N33/538;G01N33/543
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 黃行軍

技術領域

本發明涉及生物學實驗技術領域，具體是指一種利用免疫層疊法進行可溶性靶物質檢測的方法。?

背景技術

免疫學技術是一類用于生物學及醫學領域實驗研究，臨床診斷，及其相關生物制品生產監測的實驗方法。該類方法大致分為均相與固相免疫技術兩類。其發展順序可界定為傳統均相與類均相免疫，固相免疫，及其現代均相與類均相免疫等三個主要階段。各階段發展過程相互交錯，相互推進，相互補充，從而構成一套完整地免疫血清學實驗技術體系。新近，傳統均相免疫實驗因其敏感性及其操作上的諸多原因已較少在臨床（及田間）使用；現代均相免疫實驗因其技術含量過高，以及自身技術缺陷等原因尚未得以普及；而固相免疫實驗則成為迄今應用最廣泛的實驗技術。?

標記免疫學技術創建于上世紀六十年代中后期，它同時用于固相及均相免疫技術中，是免疫（血清）學實驗的一個重大技術進步。既往標記固相免疫實驗就其反應方式而言包括直接法、間接法、補體法、雙抗體（或雙抗原）夾心法、幾種不同方式的競爭與競爭抑制法，液相PAP技術，以及多種蛋白芯片技術等試驗形式，具有高度的特異性、敏感性與穩定性。操作步驟繁瑣及其定量檢測范圍狹窄是該類方法的主要缺點。自動化儀器的發展及其推廣應用使操作繁瑣的缺點從表觀上得以糾正或部分糾正，但其對實驗結果穩定性的影響并未因此而根除。現代均相（及類均相）免疫技術的研發能有效地克服固相免疫檢測操作繁瑣的弊端，并能保持與之相同或更高的特異性，穩定性與敏感性，如能克服定量范圍狹窄及其Hooks效應干擾等技術瓶頸，將具有極其廣闊地應用前景。?

現代均相免疫實驗（包括LiCA等類均相免疫試驗）是一類為簡化固相免疫實驗操作步驟而發展起來的新的試驗方法。具備與固相免疫實驗相當或更高的?敏感性，特異性與穩定性。實驗步驟較固相免疫實驗顯著簡單。其定量檢測范圍與部分發光免疫檢測技術相當（如電化學發光），但仍遠不足以對多數免疫物質作全定量檢測。Hooks效應對其試驗結果的影響較固相法相當或略重，且幾種在固相免疫檢測方法中糾正Hooks效應的反應模式，如二步法，一道洗滌法，及其排溢法等均無法用于均相免疫技術。這類技術缺陷嚴重妨礙了均相免疫技術的推廣應用。如能克服這類弊端，其使用價值可望顯著大于現行固相免疫檢測。?

傳統均相與類均相免疫檢測技術操作相對簡便，可同時進行初步的定性與定量（或半定量）檢測。該類方法敏感性偏低，定量范圍偏向靶物質含量的高濃度端，受Hooks效應影響程度相對較小等特征既是該類方法的技術缺陷，亦是它們區別于前兩類方法的重要特征。近十余年來，由于在材料與方法學上的進步，上述缺陷已部分糾正。?

“Hooks效應”或稱“鉤狀現象”是一種存在于多種血清學檢測中的量（靶物質濃度）效（檢測信號）分離現象，其發生雖可能與靶物質免疫分子的結構相關，但反應體系中靶抗原與對應抗體比例的高度失調是其最主要的原因。其表現為當反應體系中靶物質，包括抗原或抗體的濃度升高到一定程度后，檢測信號反而下降或顯著下降，甚至出現假陰性結果。隨著標記免疫學技術在敏感性上的大幅提升，尤其是當部分固相免疫實驗主要反應方式由傳統的二步法轉變為一步法（如一步法ELISA），并在我國臨床檢驗中大量普及應用后，由Hooks效應引起的檢驗結果失真便成為一個較為常見的臨床現象。這一效應直接造成檢測結果的失真，顯著妨礙科研數據的準確性，并對臨床診斷、治療及其預后的判斷造成負面影響。如果發生于某些特殊臨床檢測如采用一步法ELISA或化學發光技術進行血清HBsAg篩選，則可造成大量臨床標本的定量結果偏離真值，部分強陽性標本測值降低或顯著降低，甚至導致個別具有高度傳染性的強陽性標本出現假陰性結果。如果這種漏檢發生在獻血員篩選，則勢必導致輸血相關性肝炎的嚴重臨床事件。在我國，血清HBsAg檢測的類均相免疫檢測實驗如光激發化學發光實驗（Light?Initiated?chemilumiNescence?assay.LiCA）方法及其試劑已獲準進入臨床應用，其實驗結果受Hooks效應的影響與一步法ELISA等方法相當或更甚，若將其誤用于HBsAg的獻血員篩選，亦有可能產生與其它?一步法固相免疫檢測相似的負面效果。鑒于血清HBsAg檢測的規模及其社會影響面極大，一些存在Hooks效應干擾的檢測方法（如“一步法”ELISA與“一步法”化學發光等）已在我國獻血員HBV感染篩選中被禁止使用。LiCA也在禁用之列。?