[發(fā)明專(zhuān)利]用于檢測(cè)乙酰膽堿酯酶及其抑制劑活性的探針、用途及制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210461775.X
• 申請(qǐng)日: 2012-11-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103073427A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳小強(qiáng);周?chē)?guó)棟;王芳;王惠琳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07C69/606
• 分類(lèi)號(hào): C07C69/606;C07C67/14;C08F238/00;C08F2/48;C09K11/06;G01N21/78;G01N21/64
• 代理公司: 南京蘇科專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 32102
• 代理人: 郭百濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)乙酰膽堿酯酶及其抑制劑活性的探針、用途及制備方法。

背景技術(shù)

乙酰膽堿酯酶（AChE）活性快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于促進(jìn)人體健康以及環(huán)境保護(hù)具有重大意義。

目前用于治療老年癡呆癥的藥物主要是乙酰膽堿酯酶抑制劑，通過(guò)抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）活性來(lái)控制患者體內(nèi)乙酰膽堿含量，因此乙酰膽堿酯酶（AChE）活性檢測(cè)劑的開(kāi)發(fā)對(duì)于相關(guān)藥物的篩選具有重要作用。

此外，某些有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯農(nóng)藥會(huì)對(duì)乙酰膽堿酯酶（AChE）活性產(chǎn)生抑制作用，因此乙酰膽堿酯酶（AChE）活性檢測(cè)劑的研制對(duì)于檢測(cè)環(huán)境中有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯農(nóng)藥也能夠發(fā)揮重要作用。

傳統(tǒng)乙酰膽堿酯酶（AChE）活性檢測(cè)技術(shù)主要采用間接監(jiān)控法，該方法采用硫代膽堿作為底物，乙酰膽堿酯酶（AChE）水解該底物生成硫代膽堿，后者與二硫代硝基苯甲酸（Ellman）反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物，通過(guò)吸收光譜監(jiān)控黃色物質(zhì)的生成速度來(lái)確定酶活性。但是，該方法在使用過(guò)程中往往會(huì)有背景干擾，且靈敏度較低。

據(jù)發(fā)明人了解，應(yīng)用熒光探針的檢測(cè)方法具有良好的靈敏性，應(yīng)當(dāng)由此角度入手，研發(fā)更好的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種用于檢測(cè)乙酰膽堿酯酶及其抑制劑活性的探針、用途及制備方法。

本發(fā)明技術(shù)構(gòu)思如下：據(jù)發(fā)明人所知，氯化肉豆蔻酰膽堿(Myristoylcholine?chloride)在乙酰膽堿酯酶（AChE）作用下裂解為酸和膽堿，只要制備出能與氯化肉豆蔻酰膽堿發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生熒光的探針即可。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一種用于檢測(cè)乙酰膽堿酯酶及其抑制劑活性的探針前體，其特征是，具有如式Ⅰ所示的結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明一種制備上述探針前體的方法，其特征是，包括以下步驟：

第一步、將10,12-二炔二十五酸與氯化亞砜反應(yīng)得到式Ⅱ化合物；

第二步、將式Ⅱ化合物與三乙二醇反應(yīng)得到式Ⅰ所示探針前體。

進(jìn)一步的完善是，第一步的具體過(guò)程為：先將10,12-二炔二十五酸溶解于二氯甲烷、再加入氯化亞砜得到反應(yīng)液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下持續(xù)攪拌該反應(yīng)液直至反應(yīng)結(jié)束；然后，減壓蒸餾去除溶劑，即得式Ⅱ化合物。

進(jìn)一步的完善是，第二步的具體過(guò)程為：先將式Ⅱ化合物溶解于四氫呋喃中得到式Ⅱ化合物溶液，再將式Ⅱ化合物溶液加至含有三乙二醇的四氫呋喃溶液中、得到反應(yīng)液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下持續(xù)攪拌該反應(yīng)液直至反應(yīng)結(jié)束；然后，減壓蒸餾去除溶劑獲得粗產(chǎn)物，并將粗產(chǎn)物以層析柱純化，即得式Ⅰ所示探針前體。

更進(jìn)一步的完善是：第二步中，在層析柱純化過(guò)程中采用體積比100:2的二氯甲烷:甲醇為洗脫液。

本發(fā)明一種用于檢測(cè)乙酰膽堿酯酶及其抑制劑活性的囊泡探針，其特征是，由重量比為7:3的10,12-二炔二十五酸和式Ⅰ化合物聚合而成。

本發(fā)明一種制備上述囊泡探針的方法，其特征是，包括以下步驟：

將10,12-二炔二十五酸和式Ⅰ化合物按重量比7:3溶解于二甲基亞砜得到DMSO溶液，將DMSO溶液加至溫度為至少80℃的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液中得到反應(yīng)液，冷卻反應(yīng)液，以紫外光照射反應(yīng)液進(jìn)行聚合反應(yīng)，即得囊泡探針。

進(jìn)一步的完善是，冷卻反應(yīng)液前，將反應(yīng)液超聲、并用濾器過(guò)濾。

更進(jìn)一步的完善是，采用254nm紫外燈作為紫外光源。

此外，本發(fā)明還提供前述囊泡探針用于檢測(cè)乙酰膽堿酯酶及其抑制劑活性的用途。

本發(fā)明的囊泡探針在4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液中呈藍(lán)色且無(wú)熒光，遇氯化肉豆蔻酰膽堿發(fā)生反應(yīng)后變?yōu)榧t色并發(fā)出熒光（熒光發(fā)射波長(zhǎng)550nm左右），之后可通過(guò)加入乙酰膽堿酯酶（AChE）發(fā)生的熒光淬滅檢測(cè)乙酰膽堿酯酶（AChE）活性，或者可通過(guò)加入乙酰膽堿酯酶抑制劑和乙酰膽堿酯酶（AChE）發(fā)生的熒光恢復(fù)過(guò)程來(lái)檢測(cè)乙酰膽堿酯酶抑制劑的活性。

與現(xiàn)有檢測(cè)方法相比，采用本發(fā)明囊泡探針的熒光檢測(cè)方法反應(yīng)速度快，靈敏度高，具有適宜的熒光發(fā)射波長(zhǎng)（550nm左右），在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有極大的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2的熒光發(fā)射光譜圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的紫外可見(jiàn)光吸收光譜圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2的顏色變化圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3的熒光發(fā)射光譜圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例3的紫外可見(jiàn)光吸收光譜圖。