[發(fā)明專利]一種抗小麥黃花葉病毒轉(zhuǎn)基因小麥代謝物檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210460498.0
• 申請(qǐng)日: 2012-11-15
• 公開（公告）號(hào): CN103808818A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付偉;王玲;賀艷;朱振營(yíng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)，具體地說，涉及一種基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的抗小麥黃花葉病毒轉(zhuǎn)基因小麥代謝物檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

隨著生物技術(shù)的日趨成熟及基因工程的不斷深入，轉(zhuǎn)基因作物品種日益增多。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問題一直是全球關(guān)注的焦點(diǎn)，直接關(guān)系到人類的健康和生態(tài)環(huán)境安全。目前，代謝組學(xué)方法已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)的重要工具之一。其中，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)由于其具有分辨率高、峰容量大、靈敏度高及分析時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)而備受代謝組學(xué)研究者的青睞，該分析技術(shù)被專家稱為最寶貴的分析手段，此外，這項(xiàng)技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)是有大量可檢索的譜庫(kù)。

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，近些年通過遺傳修飾手段培育的抗病蟲、抗除草劑和雄性不育小麥方面進(jìn)行了不少有益的探索。小麥黃花葉病，亦稱“梭條花葉病”，是我國(guó)小麥生產(chǎn)中的一種重要病毒病害，主要發(fā)生在長(zhǎng)江中下游及一些分支流域，在渭河流域以及東部沿海地區(qū)也有發(fā)生。該病毒病在稻麥輪作種植區(qū)的危害尤其嚴(yán)重，一般減產(chǎn)10%~30%,重者達(dá)70%~80%,并呈逐年加重和蔓延的趨勢(shì)。小麥黃花葉病是由小麥黃花葉病毒（wheat?yellow?mosaic?virus,WYMV）引起的，該病毒由禾谷多黏菌（Polumyxa?graminis）的游動(dòng)抱子攜帶傳播，防治非常困難。同時(shí)因在多發(fā)生病害地區(qū)的主栽小麥品種對(duì)此病害表現(xiàn)敏感，而對(duì)小麥生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

于嘉林等（2002年)利用Act1啟動(dòng)子和除草劑選擇標(biāo)記bar基因，構(gòu)建了含有小麥黃花葉病毒外殼蛋白基因的植物表達(dá)載體，并采用基因槍法導(dǎo)入小麥品系，獲得了抗小麥黃花葉病毒轉(zhuǎn)基因小麥。且外源基因可以在后代中遺傳，轉(zhuǎn)基因株系的后代對(duì)小麥黃花葉病毒呈現(xiàn)高度抗性。經(jīng)Western?blot和RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抗病轉(zhuǎn)基因小麥體內(nèi)外殼蛋白基因在病毒感染后的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下降。今后抗小麥黃花葉病毒轉(zhuǎn)基因小麥的種植會(huì)迅速發(fā)展，具有極高的推廣價(jià)值和應(yīng)用前景。同時(shí)迫切需要有專門的機(jī)構(gòu)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行長(zhǎng)期、系統(tǒng)的跟蹤檢測(cè)、安全評(píng)價(jià)研究，因此建立抗小麥黃花葉病毒轉(zhuǎn)基因小麥的GC-MS技術(shù)的提取方法具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種抗小麥黃花葉病毒轉(zhuǎn)基因小麥代謝物檢測(cè)方法，特別是一種基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的抗小麥黃花葉病毒轉(zhuǎn)基因小麥代謝物檢測(cè)方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的抗小麥黃花葉病毒轉(zhuǎn)基因小麥代謝物檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的是采用以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提供的一種抗小麥黃花葉病毒轉(zhuǎn)基因小麥代謝物檢測(cè)方法，包括以下步驟：1）將抗小麥黃花葉病毒轉(zhuǎn)基因小麥的種子脫殼，磨成粉狀，加入提取溶液于4℃浸提；2）離心后干燥，加入內(nèi)標(biāo)物；3）干燥，加入衍生試劑；4）采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)衍生后的樣品進(jìn)行分析；

其中，步驟1）中所述提取溶液為體積比為2：3：3的水、乙腈和異丙醇的混合液。

優(yōu)選地，步驟4）中色譜條件為：柱箱程序：60℃保持1min，然后每分鐘10℃升溫至325℃，保持10min，1min后運(yùn)行；前進(jìn)樣器：10μl；進(jìn)樣量：1μl；載氣：He，99.999%；壓力：10.473psi；色譜柱：DB-5ms:1611.66442；DB-5ms325℃：30m×0.25mm×0.25μm；

步驟4）中質(zhì)譜條件為：EI能量：70eV；離子源溫度：230℃；四級(jí)桿溫度：150℃；溶劑延遲：7min。

前述的檢測(cè)方法，步驟1）中為向100mg粉末中加入1mL提取溶液于4℃浸提。浸提時(shí)間優(yōu)選為20min。

前述的檢測(cè)方法，步驟2）中所述離心優(yōu)選在4℃，12200g/min，離心2min。

前述的檢測(cè)方法，步驟2）中使用的內(nèi)標(biāo)物優(yōu)選為十四酸。

前述的檢測(cè)方法，步驟3）中所述衍生試劑的制備方法為：將10μl鹽酸甲氧胺溶于40mg/ml吡啶中，30℃，1500g，振蕩90min，然后加入N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺和1%三甲基氯硅烷（MSTFA+1%TMCS）90μl，37℃，振蕩30min，即得。衍生時(shí)間優(yōu)選為30min或90min。

本發(fā)明還提供一種用于抗小麥黃花葉病毒轉(zhuǎn)基因小麥代謝物GC-MS檢測(cè)的提取試劑，所述提取試劑為體積比為2：3：3的水、乙腈和異丙醇的混合液。