[發明專利]分批補加氮源培養真菌生產纖維素酶的方法

有效

• 申請號: 201210449827.1
• 申請日: 2012-11-12
• 公開（公告）號: CN102952791A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 熊鵬;宇文偉剛;賀建龍
• 申請（專利權）人: 熊鵬
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12R1/885;C12R1/66
• 代理公司: 淮安市科翔專利商標事務所 32110
• 代理人: 韓曉斌

技術領域

本發明屬于酶發酵領域，具體的說，是涉及一種發酵過程中分批補加氮源發酵生產纖維素酶的方法。?

技術背景

纖維素酶具備的水解木質纖維素成糖的能力使得其具有廣泛的應用前景，通過對秸稈等木質纖維素水解，將其發酵成糖，在通過發酵等方法制備燃料乙醇或者其他的化工產品，這也是利用木質纖維素制備能源化工產品當中一個關鍵要素之一，纖維素酶的制備成本和效率也是能否實現生物質基能源化工產品逐漸取代石油能源和化工產品的決定因素之一。?

高活性的纖維素酶發酵技術能夠極大的提高發酵效率節約產酶的成本，傳統的纖維素酶發酵通常采用液體深層間歇式發酵技術即在發酵初始配置發酵培養基時，一次性的投加足量的碳源、氮源、生長因子及微量元素等，通過控制發酵過程中的溫度、融氧、pH等保證微生物能有一個最優的發酵條件從而獲得高發酵活性的纖維素酶。該方法操作簡單，適合大多數微生物的培養，易于推廣。同時該方法在前期一次性投加整個發酵過程中所需的營養，容易導致初始培養基濃度過高造成傳質、傳熱的困難增加了發酵的能耗；發酵前期高濃度的營養會導致整個發酵培養基的滲透壓的增高不利于延滯期菌株的生長；高濃度的營養物質同時會導致前期營養物質大量的用于合成菌株生長所需要的營養，導致菌株大量繁殖，以至于后期發酵合成纖維素酶時營養緊缺從而抑制產酶。?

發明內容

本發明的目的在于：提供一種分批補加氮源培養真菌生產纖維素酶的方法，通過前期添加少量的氮源在降低發酵液滲透壓的同時降低初始培養基的營養，抑制菌絲的過量繁殖，避免大量的營養用于菌絲生長，發酵后期通過分批補氮源，在限制營養用于菌絲生長的同時保證纖維素酶合成所需要的營養供給，提高營養的利用率，獲得更高的發酵纖維素酶活。?

本發明的技術解決方案是該纖維素酶的生產方法包括如下步驟：?

（1）培養基的配制：

以纖維質原料為唯一碳源及產酶誘導劑，玉米漿(CSL)、蛋白胨、酵母膏中的一種或幾種作為培養基的有機氮源，銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨水一種或幾種的組合作為培養基的無機鹽氮源，配制培養基，于121℃滅菌20min，培養基在發酵罐中的裝液量以發酵罐裝液容量的60%~80%為宜；

（2）接種與發酵：以培養基體積的1%~5%（v/v）的接種量接種真菌種子液于發酵罐中發酵，發酵過程參數控制為：溫度為28~30℃，溶解氧不低于10%~20%，通氣量為0.1~0.3vvm?；

（3）過程補料：根據發酵過程中真菌的生長與產酶的特性分別在發酵培養第2~3天及4~5天補加質量為初始培養基中無機氮源質量的0.25~0.5倍的無機氮源或質量為初始培養基中有機氮源質量的0.25~0.5倍的有機氮源，也可以是同時補加質量為初始培養基中氮源對應質量的0.25~0.5倍的無機氮源及有機氮源。

其中，步驟（1）配制的初始培養基的氮源濃度0.05%~1%（w/v）。?

其中，步驟（2）中的真菌為木霉屬、曲霉屬的一種或兩種的組合。?

其中，所述的纖維質原料為纖維素、微晶纖維素、羧甲基纖維素制備纖維素的一種或幾種的混合。?

其中，所述的纖維質原料為經過預處理的木質纖維素，包括農作物秸稈、草類、林木生物質中的一項或幾項的組合。?

本發明具有以下做點：?

1、步驟（1）的初始培養基的氮源濃度為較低的水平，以0.05%~1%（w/v）為宜，以保證前期供應少量氮源用于菌絲生長，防止大量營養用于菌絲繁殖。

2、根據真菌的生長與產酶的特性補加氮源，在發酵前期補加無機氮能夠維持菌絲生長的基本營養易于菌絲吸收，發酵后期補加有機氮源能夠在維持菌絲基本營養的基礎上同時提供纖維素酶合成過程中所需的氨基酸等氮源營養，促進纖維素酶大量合成。?

3、補加氮源可以是單純的補加無機氮或有機氮，也可以是兩種氮源的組合補加。?

4、通過改變N源的添加方式，在發酵前期添加少量的N源以供菌絲生長，在產酶過程中分批次補加所需的N源以保證蛋白的合成，與傳統的間歇式發酵相比同濃度的C源及其他營養物質的情況下發酵所得的酶活提高了1~2倍，極大的提高了產酶發酵營養的利用率，降低了生產成本，使得該培養方法更容易適應產業化的推廣。?

附圖說明

圖1為里氏木霉Rut-30傳統間歇式發酵生長與產酶隨發酵時間變化的曲線圖。?

圖2為里氏木霉Rut-30在發酵第3天及第5天補加有機氮源玉米漿后的發酵生長與產酶隨發酵時間變化的曲線圖。?