[發明專利]一種FOX hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法

無效

• 申請號: 201210447250.0
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN102899726A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 柳參奎;南桂仙;王連勇;羅秋香;張欣欣;管清杰;馬書榮;金淑梅;李瑩;于聳
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/02;C12N15/84;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 韓末洙

技術領域

本發明涉及蒙古柳FOX?hunting農桿菌cDNA文庫的構建方法。?

背景技術

利用得到的大量擬南芥FL-cDNA（full-length?cDNA）克隆，Ichikawa等人發展了一種選擇性功能增加方式，系統闡明擬南芥基因功能——被稱為FOX?hunting?system(全稱Full-lengthcDNA?Over-expressing?gene?hunting?system)在2006年，首先作為一種技術被提出。這種方法通過在轉基因植物中過量表達單個或有限數量的FL-cDNA，產生大量顯性突變，可以根據新的重要特征，鑒定基因功能。這種技術的建立有重要的意義，為鑒定基因功能，幾種系統和工具都是產生功能缺失突變而發展起來。?

目前，擬南芥FOX植株，水稻FOX擬南芥植株和FOX水稻植株都可以用來鑒定和探索植物基因的功能，結合使用這幾種突變植株能更有效地分析基因的功能。因此，利用功能性技術，對植物的全長cDNA就可以進行基因功能分析。而現在，很多植物如大豆、小麥、柑橘和楊樹等植物的全長cDNA克隆被收集。長期以來鹽堿草源地區生長的鄉土樹種蒙古柳(Salixmongolica)。由于與其它柳樹的居群不同，其生態學特性和表現型存在差異，植物的基因也具有多樣性的特點，蒙古柳是鹽堿地寶貴的生物基因資源，蒙古柳全長cDNA文庫的研究還未見報道。?

發明內容

本發明提供了一種FOX?hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法。?

本發明的一種FOX?hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法是按照以下步驟進行的：?

一、采用異硫氰酸胍法提取蒙古柳的總RNA，然后采用試劑盒對提取的蒙古柳總RNA反轉錄成總cDNA；?

二、將步驟一反轉錄的總cDNA連接到pGEM-T載體上，構建出pGEM-cDNA，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞中，構建了pGEM-cDNA在大腸桿菌JM109中的文庫；?

三、將步驟二得到的pGEM-cDNA和pBI121載體，采用AsiSI和AscI酶分別進行雙酶切，然后將酶切后的目的片段與酶切后的pBI121載體進行連接，得到植物二元表達載體pBI121::cDNA；?

四、將步驟三得到的植物二元表達載體pBI121::cDNA，轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞中，構建出JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文庫，提取JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文庫的DNA；?

五、將步驟四得到的JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文庫的DNA通過電擊轉化導入根癌農桿菌EHA105菌株中，即完成蒙古柳FOX?hunting農桿菌cDNA文庫的構建。?

本發明包含以下有益效果：?

本發明對蒙古柳中抗逆性基因進行研究，篩選出目的基因，利用分子生物學的手段，從基因表達特性及轉基因植物對逆境的應答性進行深入細致的研究，以期獲得具有耐性的植物材料。本發明作為抗旱、耐鹽堿基礎理論研究的一部分，將為植物耐性分子育種奠定理論基礎。研究的結果不但可以豐富植物的遺傳、生理方面的理論基礎，同時對沙化土地資源的高效利用、生態環境的建設等方面具有一定的作用。?

附圖說明

圖1為具體實施方式一中提取的蒙古柳嫩芽及根的總RNA的電泳圖；其中，1為根的總RNA的電泳圖，2為葉的總RNA的電泳圖；?

圖2為具體實施方式一中蒙古柳嫩芽及根的總RNA反轉錄成總cDNA的PCR鑒定結果電泳圖；其中，1為總cDNA的電泳圖，2為λDNA用HindIII酶切3小時后的電泳圖；?

圖3為具體實施方式一中藍白斑篩選進行檢測結果；?

圖4為具體實施方式一中選取白斑進行PCR鑒定電泳結果圖；其中，1為λDNA用HindIII酶切3小時后的電泳圖，2為陰性對照；?

圖5為具體實施方式一中選取白斑進行PCR鑒定電泳結果圖；?

圖6為具體實施方式一中pBI121載體酶切檢測電泳圖；其中，1為λDNA用HindIII酶切3小時后的電泳圖，2為pBI121載體酶切后的電泳圖；?

圖7為具體實施方式一中蒙古柳cDNA表達載體的構建示意圖；?

圖8為具體實施方式一中蒙古柳pBI121::cDNA載體的JM109克隆文庫的PCR檢測結果電泳圖；其中1為λDNA用Hind?III酶切3小時后的電泳圖，2為陽性對照；?