[發明專利]一種FOX hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法

無效

• 申請號: 201210447250.0
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN102899726A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 柳參奎;南桂仙;王連勇;羅秋香;張欣欣;管清杰;馬書榮;金淑梅;李瑩;于聳
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/02;C12N15/84;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 韓末洙

1.一種FOX?hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法，其特征在于FOX?hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建是按照以下步驟進行的：

一、采用異硫氰酸胍法提取蒙古柳的總RNA，然后采用試劑盒對提取的蒙古柳總RNA反轉錄成總cDNA；

二、將步驟一反轉錄的總cDNA連接到pGEM-T載體上，構建出pGEM-cDNA，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞中，構建了pGEM-cDNA在大腸桿菌JM109中的文庫；

三、將步驟二得到的pGEM-cDNA和pBI121載體，采用AsiSI和AscI酶分別進行雙酶切，然后將酶切后的目的片段與酶切后的pBI121載體進行連接，得到植物二元表達載體pBI121::cDNA；

四、將步驟三得到的植物二元表達載體pBI121::cDNA，轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞中，構建出JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文庫，提取JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文庫的DNA；

五、將步驟四得到的JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文庫的DNA通過電擊轉化導入根癌農桿菌EHA105菌株中，即完成蒙古柳FOX?hunting農桿菌cDNA文庫的構建。

2.根據權利要求1所述的一種FOX?hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法，其特征在于步驟二中所述的轉錄的總cDNA連接到pGEM-T載體的連接體系為：

連接反應條件：16℃水浴，12～14h。

3.根據權利要求1所述的一種FOX?hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法，其特征在于步驟三中所述的AsiSI和AscI酶切體系為：

反應條件：37℃水浴，2～3h。