[發明專利]一種蛋白酶生產工藝

有效

• 申請號: 201210445985.X
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN102911925A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 常東民;孫利鵬;管寧
• 申請（專利權）人: 河南仰韶生化工程有限公司
• 主分類號: C12N9/56
• 分類號: C12N9/56;C12R1/10
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

技術領域

本發明屬于酶生產技術領域，具體涉及一種利用地衣芽孢桿菌來生產蛋白酶的工藝。

背景技術

目前，國內常采用技術水平較落后的固體發酵法來生產蛋白酶，其存在勞動強度大，生產環境條件差，染菌率高等弊端，產品多為固體粗制酶，僅能用于皮革、絲綢脫膠等少數行業，不能適應食品、飼料、洗滌劑等行業發展的需要。因而，食品、飼料、洗滌劑等對蛋白酶質量要求較高的行業普遍使用的是進口產品，其價格昂貴，增加了企業的生產成本。

發明內容

本發明目的在于提供一種蛋白酶生產工藝，該工藝原料利用率高，蛋白酶品質好。

本發明通過以下技術方案來實現上述目的。

一種蛋白酶生產工藝，其包括以下步驟：

1）種子培養：將地衣芽孢桿菌（Bacillus?licheniformis）接入斜面培養基在好氧條件下于30—37℃培養24—30h，然后將培養好的斜面菌種接入種子培養基中，于30—37℃恒溫搖床培養32—37h；再把培養好的菌種接入一級種子培養基于31—38℃培養9.5—13h；

2）發酵：將培養好的一級種子接入發酵培養基于32—38℃培養31—35h；

3）提取蛋白酶：將培養好的發酵液轉入回收罐并向其中加入硅藻土和珍珠巖，攪拌均勻，經固液分離、超濾膜超濾處理及噴霧干燥后即得。

具體的，所述步驟1）中，斜面培養基組成為：蛋白胨?0.3—0.5%，牛肉膏?0.2—0.3%，磷酸二氫鉀0.2—0.5%，瓊脂1.5—1.7%，pH自然。種子培養基組成為：蛋白胨?0.3—0.5%，牛肉膏?0.2—0.3%，磷酸二氫鉀0.2—0.5%，pH自然；一級種子培養基組成：豆粕3—5%，薯干粉2.4—3.2%，麩皮3.6—3.9%，磷酸氫二鈉0.4—0.6%，磷酸二氫鉀0.03—0.07%，菜籽油0.4—0.8%，pH自然。

所述步驟2）中，發酵培養基組成：豆粕3—5%，薯干粉2.7—3.5%，麩皮3.8—4.3%，磷酸氫二鈉0.4—0.6%，磷酸二氫鉀0.03—0.07%，菜籽油0.4—0.8%，pH自然。

所述步驟3）中，硅藻土、珍珠巖的添加量均為發酵液重量的2—6%；所用超濾膜的截留分子量為10000。

所述的蛋白酶生產工藝，具體步驟如下：

一、種子培養：

將地衣芽孢桿菌（Bacillus?licheniformis）接入斜面培養基在30—37℃恒溫培養箱中培養24—30h，然后將培養好的斜面菌種接入（接種量2—5%）裝有種子培養基的搖瓶中，于30—37℃恒溫搖床（轉速140—150r/min）培養32—37h。

將一級種子培養基投入種子罐進行滅菌（121~123℃?實消40~45分鐘），然后通風降溫到31—38℃，將搖瓶培養好的菌種以1—5%的接種量接入一級種子培養基，保證罐壓在0.05—0.08Mpa，風量在12—26m3/hr（發酵罐內的空氣需進行殺菌過濾處理）；溫度控制在31—38℃，210—270?r?/min培養9.5—13h，鏡檢，確保成熟無雜菌轉入發酵罐。

二、發酵：

將發酵培養基裝入發酵罐進行滅菌（121~123℃實消40~45分鐘），然后通風降溫到32—38℃。以5—8%的接種量，接入培養好的一級種子進行發酵，發酵時間31—35小時。

其中，在發酵過程中不同時間點的發酵溫度如下所述時，效果較好：0—2h于32—38℃培養；2—10h時，每小時升1℃，即到第10h溫度升至40—46℃；10—20h時，每小時降1℃，即到第20h溫度降至30—36℃。保證罐壓0.05—0.08Mpa；風量0~7小時190—210m³/h，發酵液與風量比（m³：m³/min，下同）為1：0.45—0.51；8~15小時風量250—280m³/h，發酵液與風量比為1：0.59—1.63。第16小時左右泡沫開始升高，此時調節風量，16h至發酵結束，發酵液與風量比為1：0.67—0.71，風量280—300m³/小時。發酵結束時，酶活力最低約達到32000U/ml。

發酵過程中，自第10—12小時開始，每4小時取樣測酶活力、PH、鏡檢菌形；第23—26小時開始，每2小時一次取樣測酶活力、PH、鏡檢菌形。連續兩次檢測酶活力不上升，鏡檢菌形50—60%芽孢以上，溫度上升緩慢或無上升趨勢，即可結束發酵。

三、提取蛋白酶