[發(fā)明專利]桂花體細(xì)胞胚再生植株的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210432277.2
• 申請日: 2012-11-01
• 公開（公告）號: CN103416302A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王彩云;鄒晶晶;高微;蔡璇;楊謝寒
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及桂花體細(xì)胞胚再生植株的方法，以桂花合子胚為外植體，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑建立桂花再生體系，以解決桂花組織培養(yǎng)技術(shù)中愈傷組織無法進(jìn)一步分化的問題。

背景技術(shù)

桂花(Osmanthus?fragrans?Lour.)屬于木犀科(Oleaceae)木犀屬(Osmanthus)，起源于亞洲，是我國特色的傳統(tǒng)十大名花之一。在18世紀(jì)70年代以后開始傳入歐洲、美國、日本、韓國、印度，在我國有2000多年的栽培歷史。桂花樹形優(yōu)美、四季常綠、香氣宜人，素有“獨(dú)占三秋壓群芳”的美譽(yù)，具有極高的觀賞價(jià)值，常常被作為重要的園林景觀和城市道路綠化樹種。

隨著對桂花食用價(jià)值的開發(fā)，市場上出現(xiàn)了以桂花作為主料或者輔料的食品，如桂花糕、桂花酒、桂花釀、桂花酥等。在食用基礎(chǔ)上桂花能夠化痰生津，暖胃、平肝、益腎、散寒，因此其藥用保健價(jià)值也逐漸開始吸引人們的注意力。桂花作為一種重要的芳香植物，不僅有者較高的食用和藥用價(jià)值，同時(shí)它也是一種極為重要的芳香資源，廣泛地應(yīng)用于面霜、精油等高檔化妝品產(chǎn)業(yè)。從桂花的果實(shí)中提取的黑色素是一種天然色素，是化工產(chǎn)業(yè)中的重要天然色素提取原料。

桂花無論在悠久的文化歷史方面，還是廣泛的經(jīng)濟(jì)效益方面，都使其擁有廣大的市場需求。但是由于桂花自交不親和、自然結(jié)實(shí)率低，種子又存在生理后熟的過程，在自然條件下不易萌發(fā)；加之一些桂花扦插苗難以生根，受季節(jié)和環(huán)境條件影響大等特點(diǎn)。因此，人們開始嘗試?yán)秒x體培養(yǎng)技術(shù)，達(dá)到大批量繁殖種苗的目的。此外，組織培養(yǎng)技術(shù)還可以挽救桂花珍貴品種，保存現(xiàn)有的優(yōu)良桂花種質(zhì)資源，縮短育種時(shí)間，不但繁殖系數(shù)大，而且能保持品種的優(yōu)良性狀，也是高等植物細(xì)胞工程、基因工程和進(jìn)一步改良的重要基礎(chǔ)之一。但是在離體培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，桂花的愈傷組織難以分化，至今國內(nèi)外尚無關(guān)于建立桂花高效體細(xì)胞胚再生體系方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對當(dāng)前桂花組織培養(yǎng)過程中愈傷組織無法進(jìn)一步分化，器官發(fā)生困難等問題，建立一種高效快速的桂花體細(xì)胞胚再生方法，為今后工廠化育苗及人工種子制備提供一條新的途徑和技術(shù)手段。

本發(fā)明以桂花優(yōu)樹種子的合子胚為起始材料，經(jīng)過對其合子胚發(fā)育狀態(tài)和取用部位的篩選比較研究，得到誘導(dǎo)桂花體細(xì)胞胚再生的最佳外植體材料，利用含不同濃度及組合的植物生長調(diào)節(jié)劑的組合設(shè)計(jì)，誘導(dǎo)得到具有進(jìn)一步分化能力的桂花胚性愈傷組織，經(jīng)過胚性愈傷組織的分化增殖、成熟萌發(fā)及生根等階段的培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)桂花經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的植株再生過程。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種由桂花體細(xì)胞胚再生植株的方法，包含下列步驟：

（1）外植體的選擇和培養(yǎng)前的預(yù)處理

每年的1月至5月晴好天氣的上午采集優(yōu)質(zhì)成年桂花樹的果實(shí)，除去外種皮和果肉，先用75%（V/V）酒精消毒15~60秒，然后用無菌水浸泡2~3次，接著用0.1%（W/V）升汞消毒5~15分鐘，最后再用無菌水清洗3~5次，在無菌條件下，剝離消毒果實(shí)內(nèi)的合子胚，備用。

（2）胚性愈傷組織誘導(dǎo)

將步驟（1）的合子胚切成1-3毫米的小片段接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每30天更換一次新鮮培養(yǎng)基，在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20~30℃，培養(yǎng)時(shí)間為20~60天，直至獲得胚性愈傷組織。本發(fā)明的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)60%~80%以上。

（3）胚性愈傷組織分化體細(xì)胞胚將步驟（1）的合子胚切成1-3毫米的小片段接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每30天更換一次新鮮培養(yǎng)基，在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20~30℃，培養(yǎng)時(shí)間為20~60天，直至獲得胚性愈傷組織，其篩選方法為：選擇顆粒性強(qiáng)、圓潤致密且有光澤的外觀，外表呈深黃色的胚性愈傷組織，剔除不具有規(guī)則外觀，顏色呈白色、外表呈淺綠色或褐色的非胚性愈傷組織。本發(fā)明的體細(xì)胞胚分化率可達(dá)60%~80%，每個(gè)外植體平均體胚分化數(shù)可達(dá)3~5個(gè)。

（4）促進(jìn)體細(xì)胞胚成熟萌發(fā)

將步驟（3）得到的分化的體細(xì)胞胚挑出，轉(zhuǎn)移到萌發(fā)培養(yǎng)基上，每30天更換一次新鮮培養(yǎng)基，在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20~30℃，培養(yǎng)時(shí)間為20~60天，使其進(jìn)一步成熟萌發(fā)；

（5）誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的生根

將步驟（4）成熟萌發(fā)的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，每30天更換一次新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)室溫度為20~30℃，每天光照時(shí)間為12~18h，光照強(qiáng)度為1500~3000lux。本發(fā)明的體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)的生根率為達(dá)70%。

（6）體細(xì)胞胚再生植株的成苗