[發明專利]桂花體細胞胚再生植株的方法

有效

• 申請號: 201210432277.2
• 申請日: 2012-11-01
• 公開（公告）號: CN103416302A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 王彩云;鄒晶晶;高微;蔡璇;楊謝寒
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種由桂花體細胞胚再生植株的方法，其特征在于，包含下列步驟：

（1）外植體的選擇和培養前的預處理

每年的1月至5月晴好天氣的上午采集優質成年桂花樹的果實，除去外種皮和果肉，先用75%（V/V）酒精消毒15~60秒，然后用無菌水浸泡2~3次，接著用0.1%（W/V）升汞消毒5~15分鐘，最后再用無菌水清洗3~5次，在無菌條件下，剝離消毒果實內的合子胚，備用；

（2）胚性愈傷組織誘導

將步驟（1）的合子胚切成1-3毫米的小片段接種于愈傷組織誘導培養基上，每30天更換一次新鮮培養基，在培養室內進行暗培養，培養溫度為20~30℃，培養時間為20~60天，直至獲得胚性愈傷組織，其篩選方法為：選擇顆粒性強、圓潤致密且有光澤的外觀，外表呈深黃色的胚性愈傷組織，剔除不具有規則外觀，顏色呈白色、外表呈淺綠色或褐色的非胚性愈傷組織；

（3）胚性愈傷組織分化體細胞胚

將步驟（2）誘導得到的胚性愈傷組織轉移到愈傷組織分化培養基上，每30天更換一次新鮮培養基，在培養室內進行暗培養，培養溫度為20~30℃，培養時間為20~60天，直至獲得分化的體細胞胚；

（4）促進體細胞胚成熟萌發

將步驟（3）分化的體細胞胚挑出，轉移到萌發培養基上，每30天更換一次新鮮培養基，在培養室內進行暗培養，培養溫度為20~30℃，培養時間為20~60天，使其進一步成熟萌發；

（5）誘導體細胞胚的生根

將步驟（4）成熟萌發的體細胞胚轉移到生根培養基上誘導生根，每30天更換一次新鮮培養基，培養室溫度為20~30℃，培養時間為20~60天，每天光照時間為12~18h，光照強度為1500~3000lux；

（6）體細胞胚再生植株的成苗

將步驟（5）生根后的再生植株轉移到生長培養基中，每30天更換一次新鮮培養基，培養室溫度為20~30℃，培養時間為20~60天，每天光照時間為12~18h，光照強度為1500~3000lux，使其進一步發育健壯，將生長健壯的再生植株移栽到含有滅過菌的基質的容器中，在溫室中于自然光照下培養生長；

其中：

上述各步驟中所使用的培養基或基質的組分及配比如下：

（1）愈傷組織誘導培養基：MS培養基，附加2,4-二氯苯氧乙酸0.1~5.0mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤0.1~5.0mg/L，蔗糖30g/L和瓊脂7g/L；培養基的pH為5.8~6.5；

（2）愈傷組織分化培養基：MS培養基，附加萘乙酸0~3.0mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤0~3.0mg/L，蔗糖30g/L和瓊脂7g/L；培養基的pH為5.8~6.5；

（3）萌發培養基：MS培養基，附加萘乙酸0~3.0mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤0~3.0mg/L，蔗糖30g/L和瓊脂7g/L；培養基的pH為5.8~6.5；

（4）生根培養基：1/2MS培養基，附加萘乙酸0~3.0mg/L，蔗糖30g/L和瓊脂7g/L；培養基的pH為5.8~6.5；

（5）生長培養基：MS培養基，附加6-芐基氨基腺嘌呤0~3.0mg/L，蔗糖30g/L和瓊脂7g/L；培養基的pH為5.8~6.5；

（6）移栽基質：腐質土：蛭石的體積比為2：1。

2.權利要求1所述的的方法在桂花組織培養中的應用。