[發(fā)明專利]一種針對蚊媒病毒的懸浮芯片多重非診斷性檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210420139.2
• 申請日: 2012-10-29
• 公開（公告）號: CN102943128A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王靜;王旺;楊宇;劉麗娟;趙婷婷;韓輝;孫肖紅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽光知識產(chǎn)權(quán)代理有限責任公司 11003
• 代理人: 張飆

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供一種針對蚊媒病毒的懸浮芯片多重非診斷性檢測方法。?

背景技術(shù)

聚合酶鏈反應(Polymerase?Chain?Reaction?,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)，也是目前核酸檢測的主流技術(shù)，PCR產(chǎn)物的檢測判定方法為瓊脂糖凝膠電泳，而瓊脂糖凝膠僅可區(qū)分相差約100bp的DNA片段。片段長度相差不大或者相等的PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳將無能無力。另外，瓊脂糖凝膠電泳通過紫外光激發(fā)熒光染料產(chǎn)生熒光來判斷是否存在PCR產(chǎn)物，檢測靈敏度相對較低。且瓊脂糖凝膠電泳通過片段的大小對產(chǎn)物進行判斷，特異性差，對非特異擴增的大小相似的片段不能區(qū)分。而且電泳時常用的染料如溴化乙錠等具有致癌性，常接觸對身體健康不利。?

蚊媒病是一組以蚊蟲為媒介而傳播的疾病，包括黃熱病、登革熱、流行性乙型腦炎、西尼羅熱等,是重要的公共健康問題。隨著全球氣候逐漸上升、城市化進程的加快、旅游和貿(mào)易的快速發(fā)展、生態(tài)環(huán)境的不斷變化，全球蚊媒傳染病發(fā)病呈上升趨勢，原有疾病的流行區(qū)域不斷擴展、疾病的流行頻度不斷增加。隨著疾病譜發(fā)生變化，相應的檢測和監(jiān)測技術(shù)要及時跟進，以適應新的疾病監(jiān)測需求。檢測及監(jiān)測蚊蟲攜帶的病原體，在傳染病監(jiān)測中屬于早期監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)傳染病流行的方法，對于蚊媒傳播疾病的有效預警和控制有重要的意義。以往的研究都是針對一種病原體檢測，且有些非診斷性檢測方法靈敏度不夠高，不能夠早期發(fā)現(xiàn)蚊媒傳染病的流行；此外,從生物學分類角度來看，蚊媒病原體涉及微生物學與寄生蟲學專業(yè)，目前蚊媒病監(jiān)測也是針對單病種，不同病原體分類專業(yè)人員分別從自身專業(yè)領(lǐng)域進行檢測，浪費人力、財力，且各專業(yè)獨力實施，不利于高效、綜合采取防治措施。因而，對于蚊媒病的檢測應當綜合考慮。?

懸浮芯片(suspension?array)也稱液相芯片（liquid?array,?liquid?chip），是一種非常靈活的多功能技術(shù)平臺，可以進行蛋白、核酸等生物大分子檢測、受體和配體識別分析等研究。懸浮芯片主要通過可偶聯(lián)探針的熒光編碼微球與兩束激光檢測，對被測物的定性和定量分析，一個反應孔內(nèi)可以完成100種不同的生物學反應，從而實現(xiàn)對核酸的多重檢測。但傳統(tǒng)的懸浮芯片的非診斷性檢測方法耗時長，步驟繁瑣，在多重檢測中，由于多重探針的存在，雜交溫度的選擇也是一個技術(shù)開發(fā)時的瓶頸。?

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測靈敏度高，特異性好的針對蚊媒病毒的懸浮芯片多重非診斷性檢測方法。?

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種針對蚊媒病毒的懸浮芯片多重非診斷性檢測方法，具體為：?

1）根據(jù)PCR擴增區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列設(shè)計特異性檢測引物，并提交GENEBANK檢測引物的特異性，合成時將上游引物5’末端連接特異Tag，下游引物5’末端進行生物素標記；

2）PCR反應結(jié)束后將反應產(chǎn)物分別與相應的編碼微球雜交；

3）微球上的Anti-Tag在一定的條件下特異的捕獲PCR產(chǎn)物上的Tag序列；

4）加入鏈霉親和素－藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結(jié)合，利用懸浮芯片LUMINAX系統(tǒng)進行檢測，通過激發(fā)微球基質(zhì)上的紅色分類熒光和微球表面經(jīng)特異性反應結(jié)合上的藻紅蛋白，對待檢測物進行定性和定量分析；

其中，所涉及的引物序列為：

進一步，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段標簽并且之間用間隔序列相連，下游引物5’端經(jīng)生物素標記。?

進一步，所述雜交中同時加入微球，PCR擴增產(chǎn)物，SA-PE，條件為37℃進行雜交，同時此條件下可以進行鏈霉親和素－藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結(jié)合。?

一種改進的針對蚊媒病毒的懸浮芯片多重非診斷性檢測方法，包括以下步驟：1）PCR檢測引物標記Tag和生物素，2）PCR擴增待檢樣品；3）加入相應的微球與PCR產(chǎn)物雜交；4）上機對雜交后的微球進行檢測；其中，根據(jù)待檢測的病毒，設(shè)計檢測所用的特異引物，上游引物5’標記不同的Tag,引物與Tag之間連接C9或C18作為加臂，下游引物5’進行生物素標記，以便檢測。?

進一步，所涉及的引物序列為：?

進一步，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段標簽并且之間用間隔序列相連，下游引物5’端經(jīng)生物素標記。?

進一步，所述雜交中同時加入微球，PCR擴增產(chǎn)物，SA-PE，條件為37℃進行雜交，同時此條件下可以進行鏈霉親和素－藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結(jié)合。?