[發(fā)明專利]菥蓂脂肪酸延長酶及其編碼基因

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210412943.6
• 申請(qǐng)日: 2012-10-24
• 公開（公告）號(hào): CN102978173A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杭悅宇;孫小芹;李瑩;龐慧;李密密;郭建林;嚴(yán)琴琴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所
• 主分類號(hào): C12N9/00
• 分類號(hào): C12N9/00;C12N15/52;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;A01H5/00
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，更具體地，涉及菥蓂(Thlaspiarvense?L.)脂肪酸延長酶(FAE1)及其編碼基因。

背景技術(shù)

芥酸(erucic?acid，C22：1)是一種超長鏈不飽和脂肪酸，主要存在于十字花科(Brassicaceae)和金蓮花科(Tropaeolaceae)植物種子中。作為植物的代謝產(chǎn)物，芥酸還在一定程度上影響植物的生長發(fā)育，在植物與環(huán)境的相互作用中，參與了生物膜角質(zhì)或蠟質(zhì)的合成。從營養(yǎng)價(jià)值來說，芥酸是食用油的抗?fàn)I養(yǎng)成分，不易被人體消化吸收，容易導(dǎo)致冠心病和脂肪肝等病害發(fā)生。然而，在工業(yè)上，芥酸及其衍生物芥酸酰胺等具有較好的增塑性和疏水性，因此，具有廣泛的用途，是生產(chǎn)潤滑劑、防腐劑、化纖原料和化妝品等化工產(chǎn)品的重要原料。

FAE1(Fatty?Acid?Elongase?1)基因是調(diào)控芥酸合成的關(guān)鍵基因，雖然自James等最先從擬南芥中克隆到FAE1基因以來，陸續(xù)有完整的FAE1基因從各種十字花科植物中被分離出來，但目前對(duì)于FAE1基因的克隆僅局限于擬南芥及蕓苔屬少數(shù)幾種植物中，而十字花科是芥酸分布的主要種質(zhì)資源，植物種類多，芥酸含量復(fù)雜，是FAE1基因克隆的合適材料。

本發(fā)明通過TaFAE1基因的真核表達(dá)，獲得活性蛋白，同時(shí)脂肪酸含量檢測分析發(fā)現(xiàn)該基因所編碼的蛋白對(duì)芥酸合成有催化活性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種來自于芥酸含量較高的埃塞俄比亞芥中的脂肪酸延長酶(Fatty?Acid?Elongase?1，F(xiàn)AE1)及其編碼基因。

本發(fā)明的菥蓂的FAE1基因由1251個(gè)堿基組成，含有一個(gè)完整的開放閱讀框，為序列表中的1號(hào)序列，將此基因命名為TaFAE1。

本發(fā)明的菥蓂FAE1蛋白由506個(gè)氨基酸組成，開放閱讀框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。TaFAE1蛋白的理論分子量為56.64kDa，等電點(diǎn)為9.56。

含有上述序列1及其開放閱讀框架的多核苷酸的載體，以及用上述序列1及其開放閱讀框架的多核苷酸轉(zhuǎn)化的生物細(xì)胞，均是本發(fā)明需要保護(hù)的內(nèi)容。

本發(fā)明基因的發(fā)現(xiàn)，使通過轉(zhuǎn)基因來調(diào)控芥酸合成成為可能，對(duì)于培育高芥酸的轉(zhuǎn)基因十字花科作物具有重要意義。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

附圖說明

圖1為菥蓂基因組DNA

圖2為TaFAE1基因全長PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3為真核表達(dá)載體pYES-TaFAE1的構(gòu)建流程圖

圖4為載體pYES-TaFAE1的酶切圖譜

圖5為酵母中TaFAE1表達(dá)產(chǎn)物的Western?Blot分析

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、基因TaFAE1的克隆

克隆TaFAE1，具體步驟如下：

一、TaFAE1基因的獲得

菥蓂在正常條件下栽培，待真葉長出，采集葉片，從葉片中提取DNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，最終獲得TaFAE1基因。

1、菥蓂基因組DNA的提取

取新鮮幼嫩的活體植物葉片約0.2g，在液氮冷凍條件下充分研磨，轉(zhuǎn)入1.5mL的離心管中，加入500μLCTAB提取液，65℃水浴45min，期間顛倒混勻3次；加入500μL體積比為24∶1的氯仿-異戊醇，混合均勻，12000r·min^-1離心15min；取上清，加2倍體積無水乙醇，-20℃冰箱中過夜；4000r·min^-1離心15min使DNA沉淀；700μL70％乙醇清洗2次，4000r·min^-1離心10min，再用700μL無水乙醇清洗1次，4000r·min^-1離心10min，得DNA沉淀晾干；最后加100μL去離子水使沉淀溶解。電泳檢測結(jié)果如圖1所示。

2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR

以上述得到的菥蓂基因組DNA為模版，以分別帶有KpnI與BamHI酶切位點(diǎn)的TFK(5′CGGGGTACCGCAATGACGTCCGTTAAC??3′)與TRB(5′CGCGGATCCGGACCGACCGTTTTGGAC?3′)為引物，按以下反應(yīng)擴(kuò)增出TaFAE1基因。反應(yīng)體系如下：