[發明專利]一種菊酯類農藥降解酶的制備方法

有效

• 申請號: 201210412214.0
• 申請日: 2012-10-25
• 公開（公告）號: CN102876642A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 黃皓;羅華建;劉玉煥;梁衛驅;胡珊;劉遠星;羅詩;莫忠興;李艷芳;陳仕麗;徐匆
• 申請（專利權）人: 東莞市農業科學研究中心;中山大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12R1/19
• 代理公司: 東莞市華南專利商標事務所有限公司 44215
• 代理人: 卞華欣

技術領域

本發明涉及農藥降解酶的制備方法技術領域，尤其涉及一種菊酯類農藥降解酶的制備方法。

背景技術

菊酯類農藥是廣譜性殺蟲劑，具有速效、高效、低毒、低殘留的特點，對140多種害蟲的防治有特效。然而，用農藥對農作物進行害蟲防治時將使農作物的表面或多或少殘留一些農藥，尤其是菊酯類農藥降解速度慢，不僅對人體健康造成危害，而且對生態系統也造成一定的影響。為此，人們采用微生物對農藥進行降解，而微生物對農藥的作用方式多樣，多數屬于通過酶促反應降解農藥。

中山大學的劉玉煥等通過（一種新型酯酶及其應用，ZL201010547206.8）中的高通量功能篩選的方法克隆了Klebsiella?sp.ZD112中具有菊酯類農藥降解能力的新基因est825，構建了重組表達的大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)/pET-28a-est825，酶學性質研究發現，通過此重組大腸桿菌生產的重組酶在常溫下對氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率分別達到80.82%，82.98%，69.23%和69.65%，菊酯類農藥降解酶降解效率高、安全無毒、環境適應強，具有良好的應用前景。

目前，國內外已出現通過構建基因組文庫克隆一個菊酯類農藥降解酶的新基因，并構建能高效表達該基因的工程菌等相關研究，如山東農業大學的閆艷春等（一種工程菌的高酶活及其固定化細胞對農藥的降解，中國環境科學，1999,19(5)）將抗性尖音庫蚊五帶亞種的抗有機磷農藥基因克隆到質粒pRL-439中，獲得高酶活工程菌，表達的酶對兩類難降解農藥（有機氯、菊酯類）可降解90%以上，但未提及產酶量；中國科學院動物研究所的喬傳令等（一種超級工程菌及其表達的解毒酶和其構建方法及應用，ZL200410042712.6）分別克隆解毒酯酶和水解酶基因，將此基因分別克隆到表達載體pETDuet-1上，構建融合表達載體pETDuet-b1-opd，最后轉化得到重組菌株并進行誘導培養，該超級工程菌和解毒酶可以同時降解馬拉硫磷、對硫磷、高效氯氰菊酯、三氯殺蟲酯等有機酸酯和有機磷類農藥，但未提及降解率及產酶量；Heidari?Rama等（Hydrolysis?of?pyrethroids?by?carboxylesterases?from?Lucilia?cuprina?and?Drosophila?melanogaster?with?active?sites?modified?by?in?vitro?mutagenesis,?Insect?Biochemistry?and?Molecular?Biology，2005,35(6):597~609）通過基因突變技術改變來源于綠蠅與家蠅的羧酸酯酶的活性位點，使得該酶對順、反式菊酯類農藥的降解能力比野生的提高很多倍，而且突變位點不同，也會影響其對順、反式菊酯類農藥的降解能力。Stok?Jeanette?E等（Identification,?expression,?and?purification?of?a?pyrethroid-hydrolyzing?carboxylesterase?from?mouse?liver?microsomes,?Journal?of?Biological?Chemistry,?279(28):29863~29869）從小鼠肝微粒中克隆了1個能降解菊酯類農藥的羧酸酯酶基因，并在桿狀病毒中表達、純化，還研究該酶對順、反式菊酯類農藥的催化常數，又從小鼠的肝微粒cDNA文庫中篩選分離第2個水解菊酯類農藥的羧酸酯酶基因。

然而，目前國內外暫缺有關采用基因工程菌高密度發酵技術高效生產菊酯類農藥降解酶的技術，因此本領域迫切需要開發高產菊酯類農藥降解酶的方法。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種菊酯類農藥降解酶的制備方法，該制備方法利用重組大腸桿菌高效生產菊酯類農藥降解酶。

本發明是通過以下技術來實現的。

一種菊酯類農藥降解酶的制備方法，包括以下步驟：

1）以重組大腸桿菌{E.coli?BL21(DE3)/pET-28a-est825}作為生產菌種，用甘油管將生產菌種在-86℃的溫度下保存；

2）種子培養：將甘油管中的生產菌種按2~4%的接種量接入搖瓶種子培養基，以轉速為200~220r/min、溫度為37℃、培養時間為8~10h的培養條件在恒溫搖床中培養；在重組大腸桿菌的發酵過程中，質粒穩定性對產物表達非常重要，在較高的溫度如37℃下，重組大腸桿菌的質粒穩定性較高。