[發(fā)明專利]一種檢測乳腺癌的microRNA標(biāo)志物集及在試劑盒中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210411571.5
• 申請(qǐng)日: 2012-10-25
• 公開（公告）號(hào): CN102925569A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝春玉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京邁譽(yù)森生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/113;G01N21/64
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)診斷領(lǐng)域，尤其涉及一類用于檢測乳腺癌的microRNA標(biāo)志物及應(yīng)用。

背景技術(shù)

microRNA是一類長度約為20-24nt的具有調(diào)控功能的非編碼RNA。其主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。

microRNA具有以下特點(diǎn)：①細(xì)胞特異性：不同組織不同細(xì)胞microRNA的表達(dá)譜特征不同；②“時(shí)空”特異性：細(xì)胞在不同發(fā)育階段，microRNA組成不同；③保守性：不同種屬、不同組織器官以及不同細(xì)胞之間相同的microRNA分子具有相似的調(diào)控功能；④穩(wěn)定性高：microRNA在PH改變，DNA以及RNA裂解酶的作用下，不易降解，具有很高的穩(wěn)定性。因此microRNA是天然的優(yōu)秀生物標(biāo)志物，已有報(bào)道不同microRNA被實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)為一些惡性疾病的分子標(biāo)志物。

2010年2月，血漿（或血清）miR-92被成功用作結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物，靈敏度可達(dá)89%，特異性達(dá)到70%，且腫瘤切除后miR-92的表達(dá)量較術(shù)前顯著降低。血清miR-92作為分子標(biāo)志物可以診斷Ⅰ～Ⅳ期的結(jié)直腸癌，早期診斷可以大大提高生存率和改善預(yù)后效果。在舌鱗狀上皮細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-184在癌組織中的表達(dá)提高了59倍以上，患者術(shù)后的血漿（或血清）miR-184表達(dá)量降低到只有原來的1/10，這表明血漿（或血清）中microRNA表達(dá)譜的變化與腫瘤組織關(guān)系密切，血漿（或血清）microRNA表達(dá)譜有可能替代組織microRNA表達(dá)譜作為腫瘤標(biāo)志物。

雖然疾病組織microRNA表達(dá)譜往往與疾病發(fā)病及預(yù)后密切相關(guān)，但是檢測技術(shù)復(fù)雜、創(chuàng)傷大，難以真正應(yīng)用于臨床診斷，且不同的microRNA對(duì)不同疾病的診斷特異性差異較大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測乳腺癌的microRNA標(biāo)志物集，通過microRNA的3’尾部添加PolyA尾，通過反轉(zhuǎn)錄PCR及熒光定量PCR的方法特異性的來檢測被測者血清或血漿中該microRNA的含量，并與正常microRNA水平比較來診斷乳腺癌，這類microRNA特異性和靈敏度高。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種檢測乳腺癌的microRNA標(biāo)志物集，所述microRNA標(biāo)志物集的序列為SEQ?ID?NO：n所示microRNA或與所述SEQ?ID?NO：n所示序列互補(bǔ)的microRNA，其中n為1至4的正整數(shù)。所述microRNA標(biāo)志物集中的1至4的每條microRNA標(biāo)號(hào)分別為miR-451，miR-148a，miR-27a，miR-30b，其序列分別為其序列為5’-ACCGT?TACCATTACT-3’（SEQ?ID?NO：1），5’-GGGTCAGTGCACT-3’（SEQ?ID?NO：2），5’-TCACAGTGGCTAAGT-3’（SEQ?ID?NO：3），5’-GTAAACAT?CCTACAC-3’（SEQ?ID?NO：4）。

上述標(biāo)號(hào)分別為miR-451，miR-148a，miR-27a，miR-30b的4條microRNA標(biāo)志物通過譜系篩查的方式，即通過以下步驟得到：

第一步：從公開發(fā)表的資料中，查找、搜集與乳腺癌相關(guān)小分子RNA（microRNA）乳腺癌標(biāo)志物，共計(jì)755條，其中，包括了世界不同人種。

第二步：選擇樣本：選擇臨床確診的、未用藥物治療的患者4人，每人術(shù)前、術(shù)后（7天）各采集血清0.5ML/份以上。放置-80度冰柜備用。并采集臨床確診乳腺癌陰性對(duì)照血清1份，血清量在0.5ML以上。

第三步：譜系篩查：用以上9份血清（術(shù)前4人份、術(shù)后4人份、1份對(duì)照），同時(shí)檢測750條選擇的小分子RNA標(biāo)志物，通過高通量分析，篩選與對(duì)照人群反向分離的標(biāo)志物，第一次譜系篩選，選擇出特異組，85條；在用以上相同檢測分析方法，第2次譜系篩查出16條，第3次篩查相對(duì)特異性高的4條，這4條小分子RNA被邁譽(yù)森生物科技有限公司確定為對(duì)中國人有較高特異性的“microRNA乳腺癌腫瘤標(biāo)志物”。

第四步：驗(yàn)證用譜系篩查出的標(biāo)號(hào)分別為miR-451，miR-148a，miR-27a，miR-30b的4條乳腺癌腫瘤標(biāo)志物。

本發(fā)明的有益效果是：篩查出的microRNA標(biāo)志物集作為用于檢測乳腺癌的特異性和靈敏度高。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

本發(fā)明還包括權(quán)利要求1所述的一種檢測乳腺癌的microRNA標(biāo)志物集在制備乳腺癌的診斷試劑中的用途。