[發明專利]五重熒光PCR快速超敏檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201210410935.8
• 申請日: 2012-10-25
• 公開（公告）號: CN102888464A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 陳悅科;張文艷;劉明霞;葉成果;王奕江;沈靖
• 申請（專利權）人: 蘇州華益美生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京萬科園知識產權代理有限責任公司 11230
• 代理人: 張亞軍;夏新

1.在單個PCR反應容器中五重檢測核酸提取液中靶核酸的實時PCR方法，所述靶核酸來自淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體，其包括，

（1）在所述單個PCR反應容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和靶核酸探針，其中所述探針標記有熒光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的熒光檢測波長互不相同，其中，

靶核酸引物對包括

ACCGTAACGTCTCTAAGTC，

GCAAGATTTCCGATTTGGC，

TGTCCATATCTTTGATACGAT，

CTCTGATATTTGAAGACTCTACA，

CTGCTCGTGAAGTATTACA，

GTACCATCTGGGAAAGTAC，

TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT，

AGTCCTCAACTTAATGTTAGA，

AGGCAGTAATGTCAATCACA，和

GGCTTTATCATTGGCAAACG，

靶核酸探針包括：

CAGACATCACGCACCGAAGCAT，

CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA，

ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA，

CCACTCTTGACATCCTTCGCATA，和

CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT；

（2）進行PCR反應，并實時檢測不同波長的熒光；和，

（3）根據熒光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有靶核酸存在于樣品中。

2.五重檢測樣品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體的方法，其包括，

（A）提取樣品中的核酸，獲得核酸提取液；和，

（B）對核酸提取液實施權利要求1所述的在單個PCR反應容器中五重檢測樣品中靶核酸的實時PCR方法。

3.權利要求1或2所述的方法，其是非診斷方法。

4.權利要求1所述的方法，其中各種探針標記有不同的熒光基團，優選熒光基團是FAM、VIC、NED、Texas?Red和CY5。

5.權利要求1所述的方法，其中PCR反應的每個循環的條件為94℃10秒、55℃15秒以及65℃45秒。

6.權利要求1所述的方法，其中每種靶核酸探針在在所述單個PCR反應容器中的濃度大于5pmol/ml，優選為6~12pmol/ml，更優選為7~10pmol/ml，最優選為8pmol/ml。

7.權利要求2所述的方法，其中提取樣品中的核酸是采用磁珠提取法提取的。

8.權利要求7所述的方法，其中提樣試品中的核酸的過程是：向樣品加入核酸萃取液（優選核酸萃取液包含異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸鈉、乙醇和pH緩沖液（如，Tris-HCl）），保溫后加入磁珠，混合均勻后，施加磁場后，棄去其中液體，然后洗滌（優選洗滌兩次，更優選其中第一次洗滌所用的洗滌液包含高氯酸鈉和乙醇，也更優選其中第二次洗滌所用的洗滌液包含乙醇)，并洗脫（優選洗脫所用的洗脫液包含pH緩沖液（如，Tris-HCl））。