[發明專利]大白菜EST-SSR標記引物及其在品種鑒定中的應用

有效

• 申請號: 201210404807.2
• 申請日: 2010-07-26
• 公開（公告）號: CN102876671A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 高建偉;劉立鋒;周新成;李化銀;李利斌;張庶
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院蔬菜研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 王緒銀

本案是申請日為2010年7月26日、申請號為201010236157.6的分案申請

技術領域

本發明涉及大白菜EST-SSR標記引物及其在品種鑒定中的應用，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

大白菜（Brassica?rapa?L.ssp.pekinensis）為十字花科蕓薹屬植物，是我國和東亞國家的重要蔬菜。品種的差異直接影響著大白菜的生產和食用品質，因此大白菜品種鑒別和純度鑒定工作非常重要。傳統的最可靠的種子純度檢測方法是GOT（grow-out?test）法，它是通過田間種植，根據形態學特征對雜交種進行鑒定。GOT法的最大缺點是費時費力、容易受環境和主觀因素的影響。近年來，同工酶、蛋白質電泳法可以用于蔬菜種子純度的鑒定，然而，一些親緣關系近、來自同一地區的蔬菜品種由于蛋白質電泳的多態性少，往往難以區分。因此，建立一套快速、精確、廉價的蔬菜種子純度檢測技術，顯得非常必要。

隨著現代分子生物學的發展，分子標記越來越多的被應用于種子純度鑒定中，如以分子雜交為基礎的RFLP、以酶切和PCR為基礎的AFLP等、以PCR反應為基礎的RAPD、SCAR、SSR、ISSR等。與其它分子標記相比，SSR標記具有許多獨特的優點。SSR標記在單個座位上能檢測到的多態性遠高于其它幾種分子標記，而且它廣泛、隨機地分布于整個基因組，具有共顯性遺傳的特點；SSR標記可以準確高效地鑒別大量等位基因；利用雜交種雙親在一些SSR位點的差異，可以將呈父母本互補帶型的雜交種與其雙親、甚至也可以將一些異源花粉造成的雜交種區分開。由于上述特點，SSR標記逐步成為蔬菜作物品種鑒定的理想分子標記之一。

迄今為止簡單重復序列(Simple?sequence?repeat,SSR)標記已在多種農作物種子的品種純度鑒定中得到應用。根據建立SSR標記序列性質不同，SSR標記可分為，基因組SSR（gSSR）和表達序列標簽SSR（EST-SSR）。與構建小片段基因組文庫進行SSR的篩選建立gSSR標記相比，從EST數據庫中獲得SSR建立EST-SSR標記要經濟得多；而且EST-SSR標記來源于DNA的轉錄區域，比gSSR標記具有更高的通用性。李新海等利用SSR標記研究了70份我國主要玉米自交系的遺傳變異（參見《中國農業科學》，2003年第36卷第6期，《利用SSR標記劃分70份我國玉米自交系的雜種優勢群》）；番興明等利用SSR標記將我國溫帶玉米主要雜種優勢群進行了劃分（參見《作物學報》，2003年11月，第29卷第6期，《利用SSR標記對29個熱帶和溫帶玉米自交系進行雜種優勢群的劃分》）；李穩香等用SSR標記對10個雜交水稻組合的子一代種子純度進行了鑒定（參見《福建農林大學》，2006年，利用SSR標記構建水稻特征指紋及種子純度分析的研究）；彭鎖堂等對我國9個主要的雜交水稻組合及其親本進行了SSR標記分析（參見《中國水稻科學》，2003年01期，我國主要雜交水稻組合及其親本SSR標記和純度鑒定）。陳琛等開發了甘藍的EST-SSR標記（參見《園藝學報》，2010年02期，甘藍EST-SSR標記的開發與應用）。李麗和鄭曉鷹建立了用于白菜和大白菜品種鑒定的由3個引物對組成的6套EST-SSR復合標記組合（參見《園藝學報》，2009年11期，用于白菜和大白菜品種鑒定的EST-SSR復合標記的建立）。但是有關大白菜EST-SSR引物的開發遠未達到飽和。為了提高EST-SSR標記的密度和提高大白菜品種鑒定的效果，有必要開發更多的EST-SSR標記。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供大白菜EST-SSR標記引物及其在品種鑒定中的應用。

大白菜EST-SSR標記引物BRE28，它由核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示的下游引物組成。

大白菜EST-SSR標記引物BRE121，它由核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示的下游引物組成。

大白菜EST-SSR標記引物BRE131，它由核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示的下游引物組成。

上述大白菜EST-SSR標記引物BRE28、大白菜EST-SSR標記引物BRE121和/或大白菜EST-SSR標記引物BRE131在大白菜品種鑒定中的應用。

上述應用，步驟如下：

（1）利用改良的CTAB法提取待鑒定樣品總DNA；