[發明專利]用于多態性的高通量鑒定和檢測的策略

有效

• 申請號: 201210390998.1
• 申請日: 2006-06-23
• 公開（公告）號: CN102925561A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: M·J·T·范艾克;H·J·A·范德珀爾
• 申請（專利權）人: 科因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 李英

本申請是申請日為2006年6月23日、申請號為200680025630.8的同名申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及分子生物學和遺傳學領域。本發明涉及快速鑒定核酸樣品中的多個多態性。經鑒定的多態性可以用于針對測試樣品中的多態性的高通量篩選系統的開發。

背景技術

長期以來，基因組DNA探查被科學團體特別是醫學團體所期望。基因組DNA是鑒定、診斷和治療疾病，例如癌癥和阿爾茲氏疾病的關鍵。除疾病鑒定和治療以外，基因組DNA的探查可以在植物和動物育種研究中帶來顯著的優勢，其可以對全世界的食品及營養問題提供答案。

已知許多疾病與特定的基因元件有關，特別地，與特定基因中的多態性有關。大量樣品例如基因組的多態性的鑒定，在目前是一項艱苦而耗時的工作。然而，該鑒定對于下述領域例如生物醫學的研究，開發藥學產品、組織分型、基因分型和群體研究具有重大價值。

發明概述

本發明提供了使用高通量方法的組合以快速而經濟的方式在復雜的例如非常大量的核酸樣品（例如DNA或RNA）中，有效地鑒定并且可靠地檢測多態性的方法。

這種高通量方法的整合提供了一種平臺，其特別適用于高度復雜的核酸樣品中的多態性的快速且可靠的鑒定和檢測，其中傳統的多態性的鑒定和繪圖是艱苦且耗時的。

本發明人的發現之一是用于多態性，優選單核苷酸多態性的鑒定的解決方案，而且同樣可用于（微）衛星和/或插入/缺失特別是在大基因組中（微）衛星和/或插入/缺失的鑒定的解決方案。該方法的獨特之處在于它對大的或小的基因組的適用性相同，并且對大基因組特別是多倍體物種尤其具有優勢。

為了鑒定SNP（和隨后檢測經鑒定的SNP），本領域有幾種可以采用的可能方法。首選方案中，對完整基因組進行測序，并且這可以對幾個個體進行。這主要是理論上的實驗，因為這是麻煩而且昂貴的，并且，盡管技術快速發展，這雖然簡單但對用于每一個生物體是不可行的，尤其是對具有大基因組的生物體是不可行的。次選方案是利用可獲得的（片段化的）序列信息，例如EST文庫。其允許生成使PCR引物，重新測序和個體間的比較。此外，其要求初始的序列信息不可得或僅僅是有限量的。進一步必須開發分別針對各個區域的PCR-分析，其增加了巨大的成本和開發時間。

第三個選擇是限定自身到各個個體的基因組的部分。困難在于，為了提供用于成功的SNP鑒定的可比較的結果，所提供的基因組的部分必須對不同個體是相同的。本發明人現在已經解決了這一難題，通過整合用于篩選部分的基因組的高度重現性方法集合和用于多態性鑒定的高通量測序，其整合于樣品制備和高通量鑒定平臺。本發明加速了多態性發現的進程并且在后續的用于所發現的多態性開發的過程中，使用相同的要件（element）可以有效且可靠地進行高通量的基因分型。

進一步設想的本發明的方法的應用，包括篩選富集的微衛星文庫，進行轉錄作譜cDNA-AFLP（數字化Northern）、復雜基因組的測序，EST文庫測序（對完整cDNA或cDNA-AFLP）、微小RNA發現（小的插入文庫的測序）、細菌人造染色體（BAC）（重疊群）的測序、批量分離分析法AFLP/cDNA-AFLP、AFLP片段的常規檢測，例如，標記輔助的回交（MABC）等等。

定義

在下面的描述和實施例中使用了大量術語。為了提供對說明書和權利要求包括這些術語給定的范圍的清楚而一致的理解，給出下面的定義。除非在此另有定義，此處所有使用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的意義。所有出版物、專利應用、專利和其他參考文獻的公開內容以其整體作為參與引入此處。

多態性：多態性指群體中核苷酸序列存在的兩個或多個變體。多態性可以包含一個或多個堿基置換、插入、重復或缺失。多態性包括，例如，簡單的序列重復（SSR）和單核苷酸多態性（SNP），其是一變異，發生于當單核苷：腺嘌呤（A），胸腺嘧啶（T），胞嘧啶（C）或鳥嘌呤（G）-改變時。變異必需在群體中通常出現至少1%才被認為是SNP。SNP構成例如所有人類遺傳變異的90%，并且在人類基因組中每100至300個堿基就有發生。每三個SNP中的兩個是胸腺嘧啶（T）取代胞嘧啶（C）。例如人或植物的DNA序列中的變異可以影響它們如何應對疾病、細菌、病毒、化學制品、藥物等。