[發(fā)明專利]高溫高效木糖發(fā)酵的耐熱工程酵母菌株及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210390901.7
• 申請(qǐng)日: 2012-10-16
• 公開（公告）號(hào): CN102876595A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪泂;汪榮亮;高曉連
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/81;C12N15/61;C12P7/06;C12R1/645
• 代理公司: 北京市漢信律師事務(wù)所 11373
• 代理人: 王文生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及通過(guò)工程菌改造提高木糖發(fā)酵的領(lǐng)域。

背景技術(shù)

溫室氣體排放的增加和全球的溫暖化、石油資源的枯竭和日益上漲的能源需求以及國(guó)家能源安全問(wèn)題使得可再生能源的利用和開發(fā)是21世紀(jì)最重要的課題之一。其中從生物質(zhì)生產(chǎn)燃料乙醇是其中重要的一個(gè)方向。木質(zhì)纖維素類是地球上最豐富的可再生生物資源(每年約200X10⁹噸的產(chǎn)量)，中國(guó)每年約產(chǎn)生10億噸農(nóng)業(yè)和森林廢棄物(Reddy?and?Yang，2005；Yinbo?et?al.，2006)，但是其中只有3％在非食品領(lǐng)域比如造紙和紙漿得到使用(Kamm?and?Kamm，2004)。

天然的木質(zhì)纖維素類主要是植物纖維原料，主要成分含有40-50％的纖維素、20-30％的半纖維素，另外還有木素等組分。其中半纖維素主要成分是木聚糖，木聚糖的水解主要產(chǎn)物是木糖。

迄今為止發(fā)現(xiàn)很多種微生物能夠代謝木糖產(chǎn)乙醇，包括細(xì)菌(Clostridia，Bacillus?spp.等)、真菌(Mucor?spp.，Rhizopus?spp.，Monilia?spp.，and?Fusaria?spp.Neurospora?spp等)和酵母菌(Candida?spp，Pichia?spp，Kluyveromyces?spp.等)。木糖的代謝和發(fā)酵都要將醛糖轉(zhuǎn)化成酮糖再進(jìn)入磷酸戊糖途徑(PPP)，按照轉(zhuǎn)化途徑的不同可分為酵母等真核生物中的木糖還原氧化途徑(即木糖還原酶(Xylose?reductase(XR)、木糖醇脫氫酶(Xylitol?dehydrogenase(XDH)及木酮糖激酶(Xylulokinase(XKS)的體系)和以細(xì)菌及一些低等真菌為主的木糖異構(gòu)酶(Xylose?isomerase(XI))的途徑(圖2)。

酵母中通過(guò)XR、XDH、XKS體系的木糖代謝和發(fā)酵已有很多文獻(xiàn)報(bào)道。其代謝途徑比葡萄糖代謝途徑復(fù)雜得多，首先是在依賴NADPH的木糖還原酶(XR)的作用下還原木糖為木糖醇，隨后在依賴NAD+的木糖醇脫氫酶(XDH)作用下氧化形成木酮糖，再經(jīng)木酮糖激酶(XK)磷酸化形成5-磷酸木酮糖，由此進(jìn)入磷酸戊糖途徑(PPP)。PPP途徑的中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通過(guò)酵解途徑形成丙酮酸。丙酮酸或是經(jīng)丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶產(chǎn)乙醇，或是在好氧條件下，最終通過(guò)三羧酸循環(huán)(TCA)及呼吸鏈徹底氧化成CO₂(Walfridsson?et?al.，1995)。目前已知至少22種酵母能轉(zhuǎn)化D-木糖成乙醇，但是只有幾種酵母菌(如：Brettanomyces?naardenensis，休合塔假絲酵母(Candida?shehatae)，Candida?tenuis，嗜鞣管囊酵母(Pachysolen?tannophilus)，Pichia?segobiensis，樹干畢赤酵母(Pichia?stipitis))能產(chǎn)生較多的乙醇。其中研究較為深入的只有三種酵母，即休合塔假絲酵母、嗜鞣管囊酵母、樹干畢赤酵母。但這些酵母的乙醇耐受性比較低，或者乙醇發(fā)酵能力還不夠高，使它們的應(yīng)用受到限制。

與之相對(duì)應(yīng)，細(xì)菌和一些真菌通過(guò)木糖異構(gòu)酶(XI)體系進(jìn)行木糖代謝和發(fā)酵。與木糖的還原氧化體系不同，木糖異構(gòu)酶體系通過(guò)異構(gòu)酶將木糖直接變成木酮糖。在這個(gè)過(guò)程中無(wú)需輔酶來(lái)氧化還原，在厭氧條件下利用木糖不會(huì)產(chǎn)生還原力的不平衡(Hahn-Hagerdal?et?al.，2007)。這個(gè)體系主要存在細(xì)菌中，在少數(shù)低等真菌中也存在(Kuyper?et?al.，2003)。能夠發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的細(xì)菌有Bacillus?macerans，Bacillus?subtilis，Clostridium?thermoaceticum等菌株。但這些細(xì)菌由于乙醇產(chǎn)率、乙醇耐受性、副產(chǎn)物及抗污染能力的問(wèn)題，而在應(yīng)用上受到限制。

由上所述，無(wú)論是酵母菌、細(xì)菌還是真菌，其野生型利用并發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇能力均有限。