[發明專利]一種具有重要藥物代謝活性的豬醛氧化酶（SsAOX1）的編碼基因及其應用

有效

• 申請號: 201210385945.0
• 申請日: 2012-10-12
• 公開（公告）號: CN102925465A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 鄧詣群;鄭鳴;唐先青;母培強
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/63;C12N1/21;C12P1/00;C12N15/10
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 謝敏楠

技術領域

本發明涉及生物基因工程領域，具體涉及一種豬醛氧化酶基因及其制備方法和應用。

背景技術

豬是國內養殖量與消費量最大的畜類動物代表，在蓄養和繁殖過程中，給豬口服各種飼料添加劑已成為養殖業中提高肉質產量的一個重要手段，但各種飼料添加劑可能會由于代謝不完全，而在豬體內殘留不完全代謝物并進一步在體內富集累積。肝臟作為最大的代謝器官，存在著豐富的藥物代謝酶系。從肝臟中分離純化或通過基因工程手段重組表達關鍵代謝酶并研究其藥物代謝能力，是研究豬體內藥物的代謝途徑和相關代謝酶的重要方法。醛氧化酶（aldehyde?oxidase，AO）是一類具有催化醛類氧化成相應的羧酸并釋放出活性氧功能的催化酶，它屬于鉬-黃素酶（molybdo-flavoenzyme，MFE）家族，分類號為EC?1.2.3.1。醛氧化酶廣泛存在于各動物物種，在動物體內又以肝臟為最豐富的分布場所。醛氧化酶是新陳代謝不可缺少的酶類，它參與多種生理調節，可以將體內形成的有毒醛氧化為無毒酸，從而緩解醛類對機體的毒害作用；也參與細胞內電子傳遞，在與代謝和繁殖相關的生理活動中起著非常重要的作用。在動物體內，醛氧化酶參與代謝產物和外源化合物的氧化降解、視黃酸合成、藥物代謝及肝臟中有毒化合物代謝，還與一些人類疾病的病理相關，其活性水平已成為醫學上臨床用藥及治療效果評估的一個重要參數。

隨著分子生物學的快速發展，一些新的技術與方法也被用在醛氧化酶的研究上，例如在小鼠中已成功借助基因敲出、定點突變和原核表達等分子生物學手段來研究醛氧化酶的生理作用和酶學功能。利用蛋白表達和純化技術獲得有活性的動物醛氧化酶，進而分析其酶學及生物學特性也是值得深入探索的研究途徑。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供豬醛氧化酶1基因及其制備方法。

本發明的上述目的通過如下方案予以實現：

本發明提供一種豬醛氧化酶1基因，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1。

本發明還提供一種所述醛氧化酶1基因所編碼的具有生物活性的蛋白，?其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2。

一種重組表達載體，包含所述豬醛氧化酶1基因。

一種包含所述重組表達載體的宿主系統。

一種催化組合劑，包含所述醛氧化酶1基因所編碼的具有生物活性的蛋白。

所述催化組合劑在催化醛類氧化成相應羧酸中的應用。

一種所述豬醛氧化酶1基因的制備方法，以豬肝組織cDNA為模板進行PCR擴增，設計的3對上、下游引物及相應序列分別為：F1：SEQ?ID?NO：3；?R1：SEQ?ID?NO：4；F2：SEQ?ID?NO：5；?R2：SEQ?ID?NO：6；F3：SEQ?ID?NO：7；R3：SEQ?ID?NO：8。

所述PCR擴增反應的條件為：98℃預變性2?min，然后98℃變性30?s，55℃退火15?s，68℃延伸30?s，共35個循環，最后68℃復延伸10?min，得如SEQ?ID?NO:1所示豬醛氧化酶1基因。

與現有技術相比，本發明的有益效果在于：通過PCR擴增得到一個豬醛氧化酶基因，并通過體外重組表達及純化體系，獲得該基因編碼的具有生物活性的蛋白，能更加有效的了解醛氧化酶的生理作用和酶學功能，從而將其更好的應用于醛類和雜環類化合物的催化合成；另一方面可針對豬體內該蛋白質的特性，設計針對性的定向藥物治療相關疾病，具有極大的市場價值。

附圖說明

圖1豬醛氧化酶1基因（SsAOX1）所編碼的蛋白與同家族種其他物種的醛氧化酶和黃嘌呤氧化酶的功能性結構域的相似性比較。

圖2豬醛氧化酶1基因（SsAOX1）序列已報道的脊椎動物醛氧化酶基因的系統進化樹

圖3豬醛氧化酶1基因（SsAOX1）的全長PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖4豬醛氧化酶的重組表達與純化SDS-PAGE電泳圖。M:?broad?range?protein?marker,?1:誘導前菌體樣品總蛋白,?2:?誘導后菌體樣品總蛋白,?3:?誘導后菌體樣品上清組分蛋白,?4:?誘導后菌體樣品沉淀組分蛋白,?5:?Ni2+親和層析純化后蛋白樣品

圖5?重組豬醛氧化酶代謝視黃醛的酶動力活性實驗

具體實施方式

本發明將通過下列實施例得到更清楚的說明，但具體實施例并不對本發明做任何限定。

實施例1?克隆豬醛氧化酶1基因（SsAOX1）

（1）豬肝臟總cDNA的分離提取

1.?取4~5月齡杜長白大三元雜交豬，頸部放血致死。