[發明專利]一種植物維管組織特異表達啟動子及其表達載體和應用

有效

• 申請號: 201210382844.8
• 申請日: 2012-10-11
• 公開（公告）號: CN102876678A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 諸葛強;王立科;楊立恒;周潔;于娟;董靜
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術領域

本發明涉及楊樹基因工程技術領域，具體涉及分離得到的楊樹（Populus?deltoides×P.?euramericana?cv.‘Nanlin895’）抗真菌蛋白基因類奇甜蛋白PeTLP2基因的啟動子，其能夠驅動一個多核苷酸序列或目的基因在植物細胞中高水平表達，并且在植物維管組織中特異表達。

背景技術

楊屬（Populus）植物作為木本植物中的模式植物，具有優良的實驗特性，包括：容易進行種間雜交和無性繁殖；生長迅速，并已建立完善的遺傳轉化體系；基因組相對較小，約450-550Mbp；易于進行遺傳研究。因此，模式植物-楊樹的基因表達調控的研究，為弄清木本植物的生長發育調控機理提供證據。

啟動子是位于結構基因5’端上游的一段DNA序列，能與RNA聚合酶及轉錄因子特異結合，控制基因轉錄起始時間和表達的程度，是基因轉錄最主要的一種調節方式。啟動子中包含多種重要的順式作用元件，其類型直接影響著基因的表達量及表達位點。因此，啟動子的分離與分析是研究基因表達調控的關鍵所在。

目前在植物表達載體中使用的大多為組成型的強啟動子：來自玉米的Ubiquitin啟動子和來自水稻的Actin啟動子，花椰菜葉病毒CaMV?35S啟動子和胭脂堿氨酸合成酶Nos啟動子。組成型啟動子可以使外源基因持續恒定的表達，但是外源基因的組成型表達不僅造成資源的浪費，重復使用同一種啟動子驅動兩個或兩個以上的外源基因還可能引起基因沉默或共抑制現象，此外還會引發轉基因植物安全性問題，因此，有必要在楊樹基因工程中采用組織器官特異性或逆境脅迫誘導型啟動子，這樣既可以是外源基因在楊樹特異組織器官中或受到逆境脅迫時高效表達，又不影響植物體的正常生長發育。

目前，已經克隆的在楊樹組織器官中特異表達或誘導型啟動子還比較少。李強等分別從歐洲黑楊和美洲黑楊中克隆到機械損傷誘導表達-Win3基因啟動子：WINP和WIDP，結果表明二者控制的GUS基因的表達不僅在損傷部位，還具有系統的因傷誘導效應。蔣浩等克隆到楊樹樹皮儲藏蛋白BSP基因啟動子，通過煙草轉基因驗證，該啟動子具有韌皮部表達特性，介導GUS基因在轉基因煙草韌皮部特異表達。張爽等從三倍體毛白楊-93中分離得到了MDCesAP這一木質部纖維素合酶基因啟動子，結果表明MDCesAP為木質部特異性啟動子。霍秀文等利用PCR方法從擬南芥基因組DNA中擴增得到了轉錄因子上游的DNA片段，初步表明該啟動子為誘導型啟動子。

隨著楊樹的廣泛栽培，病害的發生越來越嚴重，在我國，主要的楊樹病害有：葉銹病、楊樹黑斑病、楊樹炭疽病、白粉病、黑星病、潰瘍病、爛皮病、枝瘤病、干腐病、紫根病等等，已嚴重威脅楊樹的生長和木材質量，單純依靠常規育種和噴灑農藥的方法已不能從根本上解決問題。隨著世界生態環境的日益加劇，以及地理和氣候的限制，楊樹抗性育種顯得更加迫切。因此，尋找一周期短、效率高的新育種方法的工作已刻不容緩，并引起國內外林業研究者的普遍關注。

到目前為止，已經研究可用于林木抗真菌病基因工程的誘導型啟動子幾乎沒有，因此，抗真菌基因啟動子的研究對于楊樹生長和木材質量的提高有著非常重要的作用。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種植物維管組織特異表達啟動子，可用于楊樹抗真菌病基因工程育種，可以驅動目的基因在植物細胞中高效表達，并且在植物維管組織中特異表達。本發明的另一目的是提供一種上述植物維管組織特異表達啟動子的表達載體。本發明還有一目的是提供一種上述植物維管組織特異表達啟動子的應用。

技術方案：為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種植物維管組織特異表達啟動子，核苷酸序列如SEQ?NO1所示。

含有植物維管組織特異表達啟動子的表達載體。

所述的表達載體為pJIT166-pPeTLP2-GFP融合表達載體和pBin-pPeTLP2-GUS融合表達載體。

所述表達載體中的GUS或GFP可以被多種目的基因取代，例如抗蟲的Bt毒素蛋白基因和胰蛋白酶抑制劑CpTi基因。

所述的植物維管組織特異表達啟動子在楊樹維管組織中特異表達抑制真菌基因中的應用。

所述的表達載體在楊樹維管組織中特異表達抑制真菌基因中的應用。

所述的植物維管組織特異表達啟動子在培育抗真菌病楊樹新品種中的應用。

所述的表達載體在培育抗真菌病楊樹新品種中的應用。