[發明專利]一種高特異高敏感檢測分泌腸毒素蠟樣芽孢桿菌的方法

無效

• 申請號: 201210380671.6
• 申請日: 2012-10-10
• 公開（公告）號: CN103725757A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 金京勛;呂少波;李蘇楊
• 申請（專利權）人: 蘇州四同醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12Q1/14;C12Q1/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 曹毅

技術領域

?本發明涉及生物技術領域，具體的說，是一種高特異高敏感檢測分泌腸毒素蠟樣芽孢桿菌的方法。

背景技術

蠟樣芽孢桿菌是芽孢桿菌屬中的一種，1950年首次在挪威報告，會引起食物中毒，中毒者癥狀為嘔吐、腹痛、腹瀉，腹痛腹瀉是由蠟樣芽胞桿菌腸毒素引起，并且該產物不是蠟樣芽胞桿菌的標準產物之一，蠟樣芽胞桿菌產生的腸毒素與其它細菌所產生的腸毒素不相同。快速檢測分泌腸毒素蠟樣芽胞桿菌，對提高致病性蠟樣芽胞桿菌的檢測和診斷效率，確定有效治療方案具有很大意義。LAMP-PCR系統是由EIKEN株式會社開發的高特異性敏感度的核酸檢測系統，無須昂貴的設備，已經成為核酸快速檢測法的良好手段。

發明內容

本發明公開了一種高特異高敏感檢測分泌腸毒素蠟樣芽孢桿菌的方法，能快速檢測分泌腸毒素蠟樣芽胞桿菌，提高了致病性蠟樣芽胞桿菌的檢測和診斷效率。

為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現：

一種高特異高敏感檢測分泌腸毒素蠟樣芽孢桿菌的方法,包括以下步驟：

步驟1）制備反應液

反應液組成及含量為

8u/ul?Bst核酸聚合酶????????????????????????8u

10X耐熱聚合酶反應緩沖液???????????????1X，MgSO4?2mM

4M?甜菜堿???????????????????????????????????1M

10mM?d-NTP混合液??????????????????????????400μM

內引物

???BCE-FIP?????????????????????????????????40umol

???BCE-BIP?????????????????????????????????40umol

外引物

????BCE-F3?????????????????????????????????5umol

????BCE-B3?????????????????????????????????5umol

標本核酸???????????????????????????????????20ng

添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達到25ul；

步驟2）提取臨床分離分泌腸毒素蠟樣芽胞桿菌，分泌嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌、環境分離蠟樣芽胞桿菌，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應，觀察它們的陰陽性。

進一步的，所述外引物BCE-F3的序列為TGCGAAAGATAGCTGGAA。

進一步的，所述外引物BCE-B3的序列為GAATTAGCCGACTGGATGA。

進一步的，所述內引物BCE-FIP的序列為GCCCTTATGCTTTTTTTGTGTCT-ACTATGCAGAAAAGATTTATGCTG。

進一步的，所述內引物BCE-BIP的序列為AGAGGGGAATACTAAGTACATGTCA-TAAGTGACCGAAACTGGC。

進一步的，所述反應液中加入熒光顯示物質溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。

本發明的有益效果是：

本發明通過配制反應液，設計引物序列，能快速、準確的檢測出蠟樣芽胞桿菌，提高了致病性蠟樣芽胞桿菌的檢測和診斷效率，對確定有效的治療方案具有很大的指引作用。

具體實施方式

下面將結合實施例，來詳細說明本發明。

一種高特異高敏感檢測分泌腸毒素蠟樣芽孢桿菌的方法,包括以下步驟：

步驟1）制備反應液

反應液組成及含量為

8u/ul?Bst核酸聚合酶????????????????????????8u

10X耐熱聚合酶反應緩沖液???????????????1X，MgSO4?2mM

4M?甜菜堿???????????????????????????????????1M

10mM?d-NTP混合液??????????????????????????400μM

內引物

???BCE-FIP?????????????????????????????????40umol