[發(fā)明專利]一種高特異高敏感檢測大腸桿菌O157的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210380460.2
• 申請日: 2012-10-10
• 公開（公告）號: CN103725753A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金京勛;呂少波;李蘇楊
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州四同醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 曹毅

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明涉及疾病檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，是一種高特異高敏感檢測大腸桿菌O157的方法。

背景技術(shù)

?大腸桿菌O157屬腸出血性大腸桿菌，引起腸出血性腹瀉，約2%～7%的病人會發(fā)展成溶血性尿毒綜合征，兒童與老人最容易出現(xiàn)后一種情況。致病性大腸桿菌通過污染飲水、食品、娛樂水體引起疾病暴發(fā)流行，病情嚴(yán)重者，可危及生命。急需特異性和敏感度高的快速診斷試劑。

?環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)是由日本榮研（EIKEN）株式會社開發(fā)的高特異性敏感度的核酸檢測系統(tǒng)，無須昂貴的設(shè)備，已經(jīng)成為核酸快速檢測法的良好手段，本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，設(shè)計針對大腸桿菌O157特異性基因序列的一對外引物（E-F3和E-B3）和一對內(nèi)引物（E-FIP和E-BIP）進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測大腸桿菌O157的方法，提高了大腸桿菌O157的檢測和診斷效率。

為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

????一種高特異高敏感檢測大腸桿菌O157的方法，包括以下步驟：

步驟1）制備反應(yīng)液

反應(yīng)液組成及含量為

8u/ul?Bst核酸聚合酶??????????????????????????8u

10X耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液????????????????1X，MgSO4?2mM

4M?甜菜堿????????????????????????????????????1M

10mM?d-NTP混合液?????????????????????????????400μM

內(nèi)引物

???E-FIP???????????????????????????????????40umol

???E-BIP???????????????????????????????????40umol

外引物

???E-F3?????????????????????????????????????5umol

???E-B3?????????????????????????????????????5umol

標(biāo)本核酸?????????????????????????????????????20ng

添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul；

步驟2）將上述反應(yīng)液放入63℃烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽性;

步驟3）使用臨床分離大腸桿菌O157菌株核酸，以及臨床分離金黃色葡萄球菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。

進(jìn)一步的，所述外引物E-F3的序列為ACTGAAGAAATGCGATAGCT。

進(jìn)一步的，所述外引物E-B3的序列為CTAACCGGTAACGGTGAA。??

進(jìn)一步的，所述內(nèi)引物E-FIP的序列為

ACCATCCGAGCCTAGGTAGG-AATTTTGTTGCAATAATGGACTC。

?進(jìn)一步的，所述內(nèi)引物E-BIP的序列為GCTGGGGTTTGGGTTTCAAG-ACTCCTGATTCTGCACTC。

進(jìn)一步的，所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進(jìn)行實時檢查。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明通過配制反應(yīng)液，設(shè)計引物序列，能快速、準(zhǔn)確的檢測大腸桿菌O157，并及時采取相應(yīng)的措施，減少了疾病的發(fā)生率。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例，來詳細(xì)說明本發(fā)明。

?????一種高特異高敏感檢測大腸桿菌O157的方法，包括以下步驟：

步驟1）制備反應(yīng)液

反應(yīng)液組成及含量為

8u/ul?Bst核酸聚合酶??????????????????????????8u

10X耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液????????????????1X(MgSO4?2mM)

4M?甜菜堿????????????????????????????????????1M

10mM?d-NTP混合液?????????????????????????????400μM

內(nèi)引物

???E-FIP???????????????????????????????????40umol