[發明專利]一種檢測WT1基因mRNA表達量的試劑盒

有效

• 申請號: 201210380269.8
• 申請日: 2012-09-29
• 公開（公告）號: CN102912018A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 童永清;李艷
• 申請（專利權）人: 童永清;李艷
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 徐立

技術領域

本發明涉及生物技術領域的熒光定量PCR技術，具體涉及一種檢測WT1基因mRNA表達量的試劑盒。

背景技術

急性髓細胞性白血病（Acute?myeloid?leukemia，AML）是一種臨床分子異質性惡性克隆性疾病，是急性白血病最常見的類型，在美國每年有超過11,900新發病例，AML患者大多是中老年人。大約一半的成年AML患者缺乏染色體畸變，雖然這些患者有一個較長的預后期，但是只有40%能長期存活。微小殘留病（Minimal?Residual?Desease，MRD）是ALL患者經過治療，并按同前所確定的療效標準達到臨床完全緩解狀態后，體內殘留微量白血病細胞的狀態。MRD是ALL的重要的獨立預后指標。已經證實患兒體內的MRD在ALL的療效評價、預后判斷和復發監測以及造血干細胞移植時凈化移植物等方面均有十分重要的意義。

WTl（Wilms’tumour?gene?1）基因是從Wilm’s?tumour細胞的染色體中分離出來的Wilm’s瘤基因，定位于染色體11p13斷臂上，由10個外顯子組成，是一種能編碼鋅指結構轉錄因子的抑癌基因。近年來許多學者發現WT1基因作為致癌基因在各種白血病（除慢性粒細胞白血病慢性期）及其他腫瘤中被高表達，特別是AML。WTl基因與造血系統腫瘤發病有關，幾乎所有的白血病原始細胞都持續表達WT1基因，WT1基因的主要功能是參與調控細胞周期和細胞凋亡。研究表明，WT1基因表達水平上調或WT1基因突變與AML患者的臨床預后和治療效果密切相關。WTl基因約在80％的初診AML和ALL患者中有過度表達，在發生WTl基因突變的一些急性白血病者中，WTl基因的表達量會更高，現已被公認為泛白血病標記。WT1蛋白能激活轉錄激活因子或是抑制因子，大約一半的成人AML患者在診斷上缺乏同源性染色體畸變，雖然這些患者預后中等，但僅僅只有40%是長期存活的。因而需要一種特異的分子標志物來提高診斷、預測預后以及指導治療。對于接受常規化療的患者，WTl基因可以作為一個獨立的MRD監測及預后提示指標。

目前可用于WT1基因定量表達的方法有探針雜交法、基因芯片法、質譜法、基因測序法等。探針雜交法假陽性率較高；基因芯片法成本高、制備方法繁瑣；質譜法難以在普通醫療機構開展；基因測序法雖敏感性和特異性高，但價格比較昂貴，而且操作較繁瑣，耗時較長。熒光PCR（Polymerase?Chain?Reaction，聚合酶鏈式反應）檢測WT1基因定量表達可高通量完成臨床樣品檢測，且特異性和敏感性都很高。實時熒光定量PCR技術實現了PCR從定性到真正意義的定量的飛躍，為人類疾病基因的定量檢測提供了一個行之有效的檢測工具，與普通PCR相比具有特異性增強、靈敏度提高和檢測快速、降低了污染等特點，但目前尚未有熒光定量PCR方法檢測急性髓細胞性白血病中WT1基因的相關報道。

發明內容

為了解決現有技術的問題，本發明實施例提供了一種檢測WT1基因mRNA表達量的試劑盒。所述技術方案如下：

本發明實施例提供了一種檢測WT1基因mRNA表達量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括WT1基因引物、內參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中：

WT1基因上游引物序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；

WT1基因下游引物序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示；

WT1基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ?ID?NO:3所示；

ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ?ID?NO:4所示；

ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ?ID?NO:5所示；

ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ?ID?NO:6所示；

所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgC1₂、逆轉錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo(dT)₁₅、AMV逆轉錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預混合液、Mg²⁺、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和無RNase去離子水。