[發(fā)明專利]一種純化恩夫韋肽的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210375897.7
• 申請日: 2012-10-08
• 公開（公告）號: CN102827258A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐紅巖;任麗萍
• 申請（專利權(quán)）人: 吉爾生化（上海）有限公司;上海吉爾多肽有限公司;濱海吉爾多肽有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 上海浦東良風(fēng)專利代理有限責(zé)任公司 31113
• 代理人: 張勁風(fēng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于反相HPLC技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種規(guī)模化純化恩夫韋肽的方法。

背景技術(shù)

恩夫韋肽是一種人工合成的由36個氨基酸組成的鏈狀多肽。是白色或灰白色非晶型固體，在純水中幾乎不溶，但在PH7.5的緩沖液中溶解度達(dá)到82～142g/ml。分子式為C?₂₀₄?H?₃₀1N_?51?O_?64?。分子量為4492。其結(jié)構(gòu)式為：CH₃CO-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH₂。

恩夫韋肽為合成肽類HIV融合抑制藥，可與病毒包膜糖蛋白結(jié)合，阻止病毒與細(xì)胞膜融合所必需的構(gòu)象變化，從而抑制HIV-1的復(fù)制。它是近7年來抗艾滋病治療藥的先鋒，是第一個融合抑制劑。其它抗艾滋病藥物是作用于細(xì)胞內(nèi)部，阻止病毒在細(xì)胞內(nèi)部復(fù)制;而這一藥物卻是通過阻止病毒與T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的接觸融合，干擾HIV-1進(jìn)入T細(xì)胞，防止艾滋病患者的免疫系統(tǒng)遭受病毒破壞來發(fā)生作用，因此又稱為融合抑制劑。

目前涉及關(guān)于恩夫韋肽的報(bào)道基本都是合成工藝方面，而在純化工藝上基本沒有，因恩夫韋肽的理化性質(zhì)，在酸性及中性環(huán)境中溶解度極低，因此造成其在HPLC上純化的困難，使其收率極低，本發(fā)明通過在堿性環(huán)境中使用的色譜條件有效解決了這個問題，從而達(dá)到提高收率的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一條適于規(guī)模化生產(chǎn)恩夫韋肽的純化方法，主要解決恩夫韋肽在酸性及中性環(huán)境中溶解度極低，因此造成其在HPLC上純化的困難，使其收率極低的技術(shù)問題。本發(fā)明使用反相高效液相色譜法純化恩夫韋肽，并用HPLC轉(zhuǎn)鹽法交換轉(zhuǎn)鹽，效率高，成本低且收率好，達(dá)到產(chǎn)業(yè)化的要求，解決現(xiàn)有技術(shù)分離得到恩夫韋肽的空白。

?為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種純化恩夫韋肽的方法，包括如下步驟：

??1）將恩夫韋肽粗品以稀氨水完全溶解后，以濾膜過濾后待用，以固定相為聚合物色譜柱，流動相為兩相，磷酸鹽緩沖液為A相，色譜乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫一次純化，收集目的峰值含量大于80%的肽溶液；

?2）以固定相為反相硅膠色譜柱進(jìn)行二次純化同時轉(zhuǎn)鹽，流動相為兩相，醋酸水溶液為A相，色譜乙腈為B相，收集目的峰值含量大于98%的肽溶液；

3）將最終的高純度肽溶液減壓旋蒸濃縮冷凍干燥，得粉末狀成品肽。

更為優(yōu)選的方案是：所述聚合物色譜柱是以聚苯乙烯-聚乙烯苯為基質(zhì)的聚合物樹脂填料為固定相的聚合物色譜柱。

更為優(yōu)選的方案是：所述磷酸鹽緩沖液pH為7.5-8.0。

更為優(yōu)選的方案是：所述步驟1）中梯度洗脫的B相體積百分濃度為30%～50%，檢測波長為230nm。

更為優(yōu)選的方案是：所述二次純化及轉(zhuǎn)鹽所用制備柱為以十八烷基鍵合硅膠填料為固定相的反相硅膠色譜柱。

更為優(yōu)選的方案是：所述二次純化及轉(zhuǎn)鹽中醋酸水溶液體積百分濃度為2.0%，梯度洗脫的B相體積百分濃度為5%～20%～25%，檢測波長為230nm。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提出的一條適于規(guī)模化生產(chǎn)恩夫韋肽的純化工藝方法，先以聚合物制備柱在堿性條件下進(jìn)行一次純化得到純度80%以上的產(chǎn)品，再以C18填料的制備柱進(jìn)行二次純化同時轉(zhuǎn)鹽，不僅能得到HPLC純度大于98.0%的精肽，還有效地提高了產(chǎn)品的收率，降低了成本，同時生產(chǎn)方法簡單，易于操作，從而達(dá)到大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的目的。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1．樣品處理：稱取2g恩夫韋肽粗品于燒杯中，邊加入體積百分濃度為5%稀氨水邊超聲至液體澄清，用孔徑為0.45um濾膜過濾后收集濾液備用。

2．一次純化

純化條件：色譜柱：以固定相為聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質(zhì)的聚合物樹脂填料的聚合物色譜柱，柱子直徑和長度為：3cm×25cm.流動相：A相：20mmol/l磷酸氫二鈉水溶液，以氨水調(diào)pH為7.5-8.0；B相：色譜乙腈。流速：15-20ml/min。檢測波長：230nm。梯度：B相體積百分濃度為：30-50%，30-50min。進(jìn)樣量為2.0-2.5g。