[發(fā)明專利]一種鼠李糖脂作為細(xì)胞低溫或超低溫保存的保護(hù)劑應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210375337.1
• 申請(qǐng)日: 2012-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN103027032A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟琴;姜利芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物表面活性劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鼠李糖脂作為細(xì)胞低溫和超低溫保存保護(hù)劑的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

生物表面活性劑是一種具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和多樣化基團(tuán)的表面活性物質(zhì)，其主要由微生物產(chǎn)生。生物表面活性劑在環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥化工、食品以及農(nóng)業(yè)等各領(lǐng)域相比于化學(xué)表面活性劑更受青睞，因?yàn)槠渚哂幸妆唤到馇冶旧頍o毒等特點(diǎn)，使其具有較大的環(huán)境友好性及生物相容性。生物表面活性劑還因?yàn)槠湎鄬?duì)特殊的結(jié)構(gòu)而使其具有一般化學(xué)表面活性劑未能體現(xiàn)的作用。由親水的1-2個(gè)鼠李糖與親脂的1-2個(gè)脂肪酸鏈連接構(gòu)成的鼠李糖脂是目前研究最為廣泛的生物表面活性劑。其研究遍及采油、環(huán)境生物修復(fù)、化妝品、食品及醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域，最近還見報(bào)道因其獨(dú)特結(jié)構(gòu)而具有特異性殺死癌細(xì)胞的作用。?

活的動(dòng)物細(xì)胞在組織工程，細(xì)胞移植和基因工程領(lǐng)域都是極為重要的研究和治療工具，但是因?yàn)閬碓从邢尴拗屏似鋺?yīng)用。活細(xì)胞保存技術(shù)可以有效促進(jìn)其實(shí)際臨床應(yīng)用。活細(xì)胞主要是采用液氮進(jìn)行超低溫冷凍或者溫度處于0-4度的低溫保存，此技術(shù)也適合于組織、器官的保存。目前，新的保護(hù)劑諸如海藻糖等被用于細(xì)胞凍存或者低溫保存，但是還都存在保存效果不佳、保存條件要求苛刻和操作較為復(fù)雜等問題。?

雖然鼠李糖脂具有潛在的廣泛用途，但未出現(xiàn)作為細(xì)胞低溫或超低溫保存的保護(hù)劑的應(yīng)用報(bào)道。本發(fā)明采用環(huán)境、友好的生物表面活性劑鼠李糖脂，用于細(xì)胞的低溫或超低溫保存。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)海藻糖作用不顯著的缺陷，提供一種鼠李糖脂在細(xì)胞低溫或超低溫保存中的作用。?

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種鼠李糖脂作為細(xì)胞低溫或超低溫保存的保護(hù)劑應(yīng)用，將鼠李糖脂與海藻糖一起添加到細(xì)胞低溫或超低溫保護(hù)劑中，作用于活細(xì)胞，使細(xì)胞維持較高的活率和極好的功能；所述鼠李糖脂的質(zhì)量百分比濃度高于90%，鼠李糖脂的用量為5-100mg/L，海藻糖的用量為0.1-1M。?

本發(fā)明具有的有益效果是：本發(fā)明所提出的鼠李糖脂作為超低溫或低溫保?護(hù)劑，可顯著提高細(xì)胞的存活率和功能。?

具體實(shí)施方式

鼠李糖脂的使用方法見如下步驟：?

1.所用的鼠李糖脂具有高于90%以上的純度（質(zhì)量百分比濃度）。?

2.細(xì)胞的低溫保存：細(xì)胞先在37℃預(yù)培養(yǎng)12-18小時(shí)后，被轉(zhuǎn)移至0-4℃進(jìn)行低溫培養(yǎng)24-36小時(shí)，其中低溫培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基添加了0.1-1M海藻糖和5-100mg/L的鼠李糖脂。低溫保存結(jié)束后，將細(xì)胞復(fù)溫至37℃，并進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞活率及功能。?

3.細(xì)胞的凍存:由凍存培養(yǎng)液再添加0.1-1M海藻糖和5-100mg/L鼠李糖脂組成細(xì)胞凍存液，將待凍存的細(xì)胞加入到上述的細(xì)胞凍存液中，然后迅速轉(zhuǎn)移到程序降溫盒中，最后將冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。細(xì)胞復(fù)溫后進(jìn)行活率測(cè)定并通過培養(yǎng)測(cè)定細(xì)胞功能。?

下面結(jié)合具體實(shí)施例詳述本發(fā)明具體內(nèi)容及其所帶來的顯著效果。?

實(shí)施例1、大鼠肝細(xì)胞凍存中使用鼠李糖脂?

大鼠肝細(xì)胞作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有體積大、易敏感的特點(diǎn)，因而凍存難度較大。對(duì)自行分離得到的大鼠肝細(xì)胞采用凍存的方法。為了考察鼠李糖脂和海藻糖聯(lián)用的作用，細(xì)胞凍存采用了三種保護(hù)劑配方。?

配方1：1640低碳培養(yǎng)基70%，DMSO?10%，F(xiàn)BS?20%，再添加580μM甘草酸二銨,2mM維生素E，0.1M海藻糖和不同濃度的鼠李糖脂。?

配方2：1640低碳培養(yǎng)基70%，DMSO?10%，F(xiàn)BS?20%，再添加580μM甘草酸二銨,2mM維生素E，1M海藻糖和不同濃度的鼠李糖脂。?

配方3：1640低碳培養(yǎng)基70%，DMSO?10%，F(xiàn)BS?20%，再添加0.1M海藻糖和不同濃度的鼠李糖脂。?

細(xì)胞凍存一段時(shí)間后水浴復(fù)溫，用臺(tái)盼藍(lán)染色的方法測(cè)定細(xì)胞活率,結(jié)果見表1.?

表1：鼠李糖脂對(duì)大鼠肝細(xì)胞凍存后活率的影響?

從以上結(jié)果可以看出，凍存液的組成對(duì)鼠李糖脂的作用沒有明顯影響，鼠李糖脂的加入都可以顯著提高細(xì)胞的活率，特別是較低濃度（10mg/L）的鼠李糖脂就可以產(chǎn)生較為顯著的效果。細(xì)胞復(fù)溫后鋪板培養(yǎng)24和120小時(shí)候進(jìn)行形態(tài)觀察,加入了鼠李糖脂的細(xì)胞能夠形成更多更大的島狀結(jié)構(gòu)，而且細(xì)胞形態(tài)也更為立體。?

實(shí)施例2：鼠李糖脂對(duì)大鼠肝細(xì)胞凍存后的肝細(xì)胞功能的影響?