[發(fā)明專利]一種基于化學(xué)衍生的尿液中甾體激素的檢測方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210374874.4
• 申請(qǐng)日: 2012-09-27
• 公開（公告）號(hào): CN103698414A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許國旺;戴偉東;尹沛源;路鑫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分析化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，是一種基于化學(xué)衍生技術(shù)用于提高尿液中甾體激素檢測靈敏度的新方法。

背景技術(shù)

甾體激素，又稱類固醇激素，是一類具有環(huán)戊烷多氫菲母核的四環(huán)脂肪烴化合物。甾體類激素在人體內(nèi)具有極其重要的生理作用，表現(xiàn)在維持生命，調(diào)節(jié)性功能，機(jī)體的生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、皮膚功能等各個(gè)方面。當(dāng)體內(nèi)的甾體激素代謝失衡時(shí)，會(huì)導(dǎo)致各種各樣的疾病。近年來研究還發(fā)現(xiàn)甾體激素在前列腺癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。因此，測定人體體液中一系列的甾體激素（即甾體激素代謝組），即通過代謝組學(xué)的方法檢測甾體激素，對(duì)于研究疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、人體對(duì)疫病的應(yīng)答以及更好的個(gè)性化的給藥治療方案都具有積極的意義。

在以往的甾體激素檢測中，往往是通過免疫分析（immunoassay）的方法對(duì)單個(gè)激素進(jìn)行檢測。但是免疫分析的方法由于基質(zhì)干擾效應(yīng)和批次之間較大的差異性，使得檢測的特異性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性均較低。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）可以提高甾體激素檢測的特異性，而且可以進(jìn)行多種激素的同時(shí)檢測。但是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)由于前處理比較繁瑣而且靈敏度相對(duì)較低，在臨床檢測中并不常用。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前較理想的對(duì)甾體激素代謝組進(jìn)行檢測的技術(shù)。

直接（不經(jīng)過衍生化）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法（LC-MS/MS）是目前較為常用的方法，具有前處理較為簡單，方法穩(wěn)定可靠的優(yōu)點(diǎn)，但是由于不同的甾體激素在離子化過程中的差異較大，許多甾體激素在電噴霧離子源中的離子化效率很低，造成其檢測靈敏度很差。因此在實(shí)際檢測中，只有部分甾體激素可以被高靈敏度檢測和定量。衍生化方法是提高離子化效率一種比較常用的方法。目前通過丹磺酰氯衍生化的方法可以提高雌激素的檢測靈敏度，并被用于尿液和血漿中甾體激素的檢測。但是丹磺酰氯對(duì)分子結(jié)構(gòu)中不含酚羥基的雄激素、皮質(zhì)激素和孕激素不能進(jìn)行衍生化，使其適用范圍不能覆蓋整個(gè)甾體激素代謝組。進(jìn)一步對(duì)已有衍生化方法的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行檢索，也沒有一種可以覆蓋整個(gè)甾體激素代謝組的方法。針對(duì)上述情況，我們提出了一種有望覆蓋整個(gè)甾體激素代謝組的新的衍生化技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種基于化學(xué)衍生的尿液中甾體激素的檢測方法，使其用于檢測人體尿液中甾體激素，為了解機(jī)體的生理過程、疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、機(jī)體對(duì)病變和藥物的應(yīng)答以及個(gè)性化治療方案提供有效的信息和依據(jù)。該方法具有靈敏度高、精確、重復(fù)性和穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

具體步驟如下，

第一步：收集尿液，離心后保存。

所述保存，其溫度-20℃。

第二步：取第一步得到的尿液，采用SPE柱提取其中的甾體激素。

所述尿液，其用量為500μL，所用的SPE柱為Waters?Oasis?HLB柱（30mg）。SPE洗脫步驟如下：

1）SPE柱先用2mL甲醇平衡；

2）然后用2mL去離子水水洗；

3）上樣：在500μL尿液中加入50μL水和450μL甲醇，并將這1mL的溶液上樣至SPE柱上；

4）淋洗：正壓條件下用1mL45％甲醇溶液淋洗3次；

5）洗脫：正壓條件下用1.5mL90％甲醇溶液進(jìn)行洗脫。

第三步：過SPE柱的洗脫液進(jìn)行冷凍干燥；

第四步：進(jìn)行衍生化反應(yīng)：在冷凍干燥的離心管內(nèi)，加入4-二甲氨基苯甲酸（DMAB），4-二甲氨基吡啶（DMAP）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺（EDC）的二氯甲烷溶液，渦旋混勻，轉(zhuǎn)移至玻璃進(jìn)樣小瓶中，蓋上瓶蓋密封，水浴加熱進(jìn)行衍生化，然后蒸干二氯甲烷溶液。

所述DMAB濃度為2mg/mL，溶液為二氯甲烷，體積為80μL。

所述DMAP濃度為2mg/mL，溶液為二氯甲烷，體積為80μL。

所述EDC濃度為5mg/mL，溶液為二氯甲烷，體積為80μL。

所述水浴加熱溫度為75℃，水浴時(shí)間為5小時(shí)。

所述蒸干二氯甲烷溶液溫度為45℃，時(shí)間約為10分鐘。

第五步：加溶解液渦旋溶解殘?jiān)却合嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)樣分析。

所述溶解殘?jiān)娜軇?0％乙腈/水溶液，體積200μL。

所述溶解殘?jiān)臏u旋時(shí)間為1分鐘。

第六步，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測分析甾體激素。