[發明專利]檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法

無效

• 申請號: 201210372059.4
• 申請日: 2012-09-28
• 公開（公告）號: CN102879585A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 吳金節;王希春;寇亞楠;孫志闊;徐述亮;陳亮;王勇;馬良友
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務所 34116
• 代理人: 胡敏

技術領域

本發明涉及一種檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

大豆是動物養殖中應用最廣泛的一種優質植物蛋白源，不僅蛋白質含量高，價格低廉，而且必需氨基酸的絕對含量高，且氨基酸的組成比例平衡。但是，大豆中存在的致敏因子能引發人和動物，尤其是嬰幼兒和幼齡動物的過敏反應，從而導致腹瀉和消化吸收障礙，甚至死亡，造成了重大損失，限制了其在生產上的應用。研究表明，引起動物發生過敏反應的主要致敏因子是大豆抗原蛋白，而大豆球蛋白(glycinin)和β-伴大豆球蛋白?(β-conglycinin)又是大豆抗原蛋白中的主要抗原成分。按離心沉降系數和免疫學方法又把大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分別稱為11S蛋白和7S蛋白，二者約占到大豆蛋白的70%。目前，大多研究使用膨化、熱乙醇變性法、熱加工法等處理方法，使致敏因子變性失活；或通過改善酶的作用條件，優化酶制劑的組合，利用外源酶對大豆抗原蛋白進行酶解從而去除抗原蛋白；或使用蛋白質糖基化工程對蛋白質表面的糖鏈進行改造，來改良蛋白質性質；或利用基因敲除的方法使某些基因無法表達，從而消除大豆中的致敏因子。這些方法不能完全去除致敏物質，而且去除條件要求高，成本增加，雖然有新品種培育出，但需要復雜的食品安全評估過程和農業推廣問題，導致其無法在生產實踐中得到廣泛應用。目前，國內外主要采用飼料中抗原檢測的方法來除去由大豆抗原蛋白引起的食源性過敏問題。這種方法只能作為一種預防手段，不能對已經過敏的動物進行有效的辨別和診斷，延誤病情，不能及時除去過敏原，導致動物病情加重，造成重大經濟損失。因此實現從動物體的過敏反應出發，探索出一種可以對大豆抗原蛋白過敏反應動物的鑒別和診斷方法具有現實意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種檢測仔豬大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法，為人和動物大豆球蛋白過敏性疾病的防治和發病情況的掌握提供一種快速、簡便的檢測方法。

本發明是通過以下技術方案來實現的。

一種檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法：

是以經純化的大豆抗原蛋白作為抗原包被，用以檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法。

進一步地，上述大豆抗原蛋白包括大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。

進一步地，上述純化步驟包括：

將大豆抗原蛋白溶于PH為7.4的磷酸鹽緩沖液，再使用Sepharose?CL-6B凝膠過濾，用磷酸鹽緩沖液洗脫得到的洗脫液經透析，冷凍干燥得大豆抗原蛋白，儲存于-20℃作為抗原備用。

進一步地，上述間接ELISA方法包括：包被抗原、封閉、加樣、加酶標二抗、顯色、終止。

進一步地，上述間接ELISA方法的工作條件為：抗原包被為2.0~10.0μg?/L，封閉液為1%BSA，樣品稀釋濃度為1：400~1：3200，酶標二抗稀釋濃度為1:1000~1:3000，顯色液AB比例為等比，陰陽臨界值為0.225~0.032。

本發明的有益效果：

建立的檢測仔豬大豆球蛋白抗體的間接ELISA方法，該方法對大豆抗原蛋白引起的人和動物過敏性疾病有較強的敏感性和特異性，為這類疾病的診斷提供依據，有助于解決我國動物的大豆蛋白源性食物過敏問題，為這類疾病的疾病學調查提供有效的技術手段，為人和動物大豆抗原蛋白過敏性疾病的防治和發病情況的掌握提供一種快速、簡便的檢測方法。

附圖說明

圖1為大豆球蛋白(11S蛋白)的蛋白洗脫峰數據說明圖；

圖2為大豆球蛋白(11S蛋白)的電泳分析數據說明圖；

圖3為β-伴大豆球蛋白(7S蛋白)的蛋白洗脫峰數據說明圖；

圖4為β-伴大豆球蛋白(7S蛋白)的電泳分析數據說明圖。

具體實施方式

下面根據實施例和附圖說明對本發明作進一步詳細說明。

實施案例1：

本發明提供的間接ELISA方法，其中，以大豆球蛋白(11S蛋白)為檢測抗原：

（1）抗原的純化及純度分析

純化：將11S蛋白溶于pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，Sepharose?CL-6B凝膠過濾(l.6×120?cm層析柱)，用磷酸鹽緩沖液洗脫得到的洗脫液經透析，冷凍干燥得大豆球蛋白(即11S蛋白)，儲存于-20℃作為抗原備用。其中圖1為大豆球蛋白(11S蛋白)的蛋白洗脫峰數據說明圖，純化數據可參照圖1。