[發(fā)明專利]一種雙鏈RNA的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210368291.0
• 申請(qǐng)日: 2012-09-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102876677A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬文明;俞炎琴;莊浩瀚;錢葉青;楊勁樹(shù);楊帆;楊衛(wèi)軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)舟山海洋研究中心
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 杜軍

1.?一種雙鏈RNA的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

步驟(1).基因克隆：利用PCR擴(kuò)增的方法克隆目的基因分子；

根據(jù)目的基因分子的cDNA序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的正向引物和反向引物；以目的基因分子的cDNA序列為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆目的基因分子，得到PCR產(chǎn)物；PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析；采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的PCR產(chǎn)物；

步驟(2).載體構(gòu)建：利用pET-T7質(zhì)粒構(gòu)建含有目的基因片段的表達(dá)載體；

純化后的PCR產(chǎn)物和pET-T7質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，得到目的基因的酶切產(chǎn)物和pET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；目的基因的酶切產(chǎn)物和pET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒純化，得到純化后目的基因的酶切產(chǎn)物和純化后pET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；利用DNA連接試劑盒連接純化后目的基因的酶切產(chǎn)物和純化后pET-T7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.?coli?DH5α中，涂板，30～37^oC培養(yǎng)12～24小時(shí)；挑選陽(yáng)性單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳分析；選取含有目的基因片段的陽(yáng)性單菌落，測(cè)序分析插入基因片段序列的正確性，得到含有正確基因片段插入的單菌落；

步驟(3).載體轉(zhuǎn)化：?

挑取經(jīng)鑒定含有正確基因片段插入的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，30～37^oC條件下培養(yǎng)12～24小時(shí)，離心得到沉淀；利用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提沉淀菌體中的pET-T7表達(dá)載體，凝膠電泳檢測(cè)抽提產(chǎn)物；將含有基因片段插入的pET-T7表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)型菌株E.coli?HT115中，涂板培養(yǎng)，挑選陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，凝膠電泳分析，選取含有目的載體的陽(yáng)性菌落，保存待用；此處的含有目的載體的陽(yáng)性菌落為攜帶pET-T7載體的E.coli?HT115單菌落；

步驟(4).雙鏈RNA的誘導(dǎo)表達(dá)：

將攜帶pET-T7載體的E.coli?HT115單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，30～37^oC條件下培養(yǎng)12～24小時(shí)；以1:20～1:50的比例擴(kuò)大培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.4～1.0；在LB液體培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG溶液，加至IPTG在LB液體培養(yǎng)基中的終濃度為0.2～1.0mmol/L，30～37^oC誘導(dǎo)培養(yǎng)2～8小時(shí)；離心收集細(xì)菌沉淀，磷酸緩沖液漂洗，得到漂洗后的細(xì)菌沉淀，保存待用；

步驟(5).雙鏈RNA的純化：

總RNA抽提：取漂洗后的細(xì)菌沉淀，利用Trizol試劑盒提取漂洗后的細(xì)菌沉淀中的總RNA；

變性：將提取的總RNA溶解于核糖核酸酶A緩沖液中，80～90^oC變性5～15分鐘，得到變性溶液；

復(fù)性：將變性溶液置于水浴中冷卻至常溫，使得變性溶液復(fù)性，得到復(fù)性后的溶液；

酶切：在復(fù)性后的溶液中加入核糖核酸酶A進(jìn)行酶切，加至核糖核酸酶A在復(fù)性后的溶液中的終濃度為10～50μg/ml，在35～37^oC條件下反應(yīng)10～60分鐘，去除單鏈RNA，得到酶切后產(chǎn)物，電泳檢測(cè)酶切效果；

純化：在酶切后產(chǎn)物中加入與酶切產(chǎn)物等量體積的酚氯仿溶液，充分混勻，離心取上清液；在上清液中加入2～3倍上清液體積的無(wú)水乙醇，充分混勻，靜置，沉淀雙鏈RNA，離心收集沉淀物；用70～75﹪乙醇充分洗滌，離心收集沉淀，自然干燥；

溶解：加入滅菌水溶解沉淀，所得溶液即為純化后的雙鏈RNA樣品；凝膠電泳檢測(cè)雙鏈RNA樣品，分光廣度計(jì)法測(cè)定核酸樣品濃度，-30～-20^oC保存待用。

2.如權(quán)利要求書1所述的一種雙鏈RNA的制備方法，其特征在于步驟(3)和步驟(4)所述的LB液體培養(yǎng)基為含10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉和50μg/ml?氨芐青霉素的水溶液，pH為7.4。

3.如權(quán)利要求書1所述的一種雙鏈RNA的制備方法，其特征在于步驟(4)所述的磷酸緩沖液為含8g/l氯化鈉NaCl，0.2g/l氯化鉀KCl，1.38g/l磷酸氫二鈉Na₂HPO₄，0.24g/l磷酸二氫鉀KH₂PO₄的水溶液，pH為7.4。