[發(fā)明專利]一種龍山百合高效脫毒工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210364720.7
• 申請日: 2012-09-18
• 公開（公告）號: CN102870676A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設計）人: 顏芳燕;周曉波;向德高;丁茁荑;張治國;吳藝飛;白占兵
• 申請（專利權(quán)）人: 龍山縣生物科技開發(fā)公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種龍山百合高效脫毒工藝，特別是針對龍山百合，具有極高脫毒效率的脫毒新技術(shù)。

背景技術(shù)：

湘西龍山縣是中國著名的“百合之鄉(xiāng)”，常年種植面積穩(wěn)定在5萬畝以上，占全國種植面積的1/6，是全國種植百合最多的縣份。百合在生產(chǎn)上主要以扦插繁殖和分球繁殖等無性繁殖為主。長期以來，龍山百合種苗基本上依靠農(nóng)民自留，品種退化嚴重。近年來，百合病毒病已普遍存在于全縣各百合產(chǎn)區(qū)，侵染率已達100％，產(chǎn)量和品質(zhì)正逐年下降，嚴重制約了百合產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。如何減少和消除病毒病，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)無毒種苗，是龍山縣百合種球商品化生產(chǎn)面臨的一個重要問題。目前，國內(nèi)外尚無有效藥劑防治病毒病的條件下，最方便可靠的措施是通過莖尖組織培養(yǎng)，生產(chǎn)脫毒種球(除去病毒，同時也除去真菌、細菌、線蟲等其它病原物)。

病毒病主要是通過營養(yǎng)體無性繁殖傳播的。無性繁殖方式的優(yōu)點在于能保持其后代遺傳基礎的一致，較少發(fā)生變異。然而長期的無性繁殖將會使體內(nèi)逐漸積累大量病毒致使植物發(fā)生病毒病，并導致種性退化。自Stewart(1896)描述百合的壞死條紋以來，相繼報道了百合的病毒病原14種。其中發(fā)生普遍、危害嚴重的病毒有5種。即百合潛隱病毒(Lily?symptomless?virus，LSV)；黃瓜花葉病毒(Cucumber?mosaic?virus，CMV)；郁金香碎錦病毒(Tulip?breaking?virus，TBV)；異名百合斑駁病毒(Lilymottlevirus，LMoV)和百合叢簇病毒(Lilyrosettevirus，LRV)。其余9種病毒在栽培地區(qū)少量發(fā)生，對百合構(gòu)不成普遍危害。

目前國際上有幾個國家已經(jīng)獲得百合無病毒苗，并在大規(guī)模的生產(chǎn)。阻斷病毒傳播獲得脫毒苗的基本方法有：莖尖培養(yǎng)、珠芽培養(yǎng)、化學處理、熱處理。

①莖尖培養(yǎng)

莖尖培養(yǎng)脫毒的依據(jù)是：病毒在患病的植株上分布不均勻，在幼嫩的或未成熟的組織和器官中病毒含量較低，而莖尖是植株中最年輕，細胞分裂最活躍的部位；病毒一般通過維管束轉(zhuǎn)移，莖尖分生組織沒有維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不上細胞分裂和生長的速度，所以它幾乎不含或很少含病毒。植物莖尖中無毒生長點培養(yǎng)，成了去除植物中病毒使植物復壯的重要方法。

莖尖脫毒培養(yǎng)的2個關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)是莖尖的成活率和脫毒率。莖尖培養(yǎng)成活率低，褐化是降低莖尖培養(yǎng)成活率的首要因素。褐化的發(fā)生與許多因素有關(guān)，莖尖大小、取材季節(jié)、培養(yǎng)方式、激素濃度、基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加物都對莖尖褐化有影響，例如莖尖越小，褐化越嚴重、成活率越低。在莖尖培養(yǎng)時為抑制褐化的發(fā)生，需要優(yōu)化上述各因子。

百合通過莖尖培養(yǎng)，TBV、CMV、LSV等病毒的檢出率可降至7％以下，可有效地脫除病毒。云南省農(nóng)科院花卉所的研究表明，剝?nèi)?.2～0.3mm的莖尖成苗率可達到78％，但脫毒率僅為43％。

②珠芽培養(yǎng)

珠芽培養(yǎng)時先剝掉外部鱗片，把帶有葉原基的珠芽生長點經(jīng)消毒，無菌水沖洗數(shù)次后，剝掉部分葉原基，最后將帶有1～2個葉原基的生長點在解剖鏡下切成0.3～1.2mm不同長度小段進行培養(yǎng)。趙樣云等實驗表明，利用0.3～0.8mm珠芽生長點對淡黃花百合進行離體培養(yǎng)，通過脫分化產(chǎn)生愈傷組織，然后將愈傷組織再分化成芽，最后培育出的幼苗可成功地脫去煙草環(huán)斑病毒。

③化學處理

抑制植物病毒的活性化學物質(zhì)包括代謝拮抗物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等，其中一些已用于植物脫毒研究。病毒唑是廣譜性抗病毒藥物，國外在20世紀70年代末和80年代初，一些科學家將這種抗動物病毒的藥物應用于植物，成功地脫去了馬鈴薯X病毒、黃瓜花葉病毒和苜蓿花葉病毒等。實驗人員將感染了CMV、LSV、TBV的百合鱗片接種于含病毒唑或二硫脲嘧啶的培養(yǎng)基上，隨培養(yǎng)時間的延長，病毒濃度降低，約40％再生的小鱗莖可脫除病毒。百合離體培養(yǎng)過程中加入抗病毒抑制劑DHT，可有效地去除CMV和LSV，并且對芽的分化影響很小。在百合生產(chǎn)上，采用礦物油、植物油、殺蟲劑和外激素噴灑，可控制百合病毒病蔓延。也可采用礦物油和擬除蟲菊酯殺蟲劑混合物進行噴灑，控制百合蚜蟲傳播的百合潛隱病毒和百合斑駁病毒。

④熱處理

熱處理依據(jù)是在高溫下病毒出現(xiàn)鈍化，其復制明顯減弱或不再繁殖。將植物在高溫下培養(yǎng)數(shù)周至數(shù)月，這個期間生長的嫩梢不帶病毒。植株的存活率和脫毒率受溫度的高低和持續(xù)時間長短的影響。大部分百合病毒在50～65℃活性穩(wěn)定，所以處理溫度在65～75℃，才能鈍化病毒。但溫度過高，會降低植株的成活率。在實踐中，利用較高溫度處理時，縮短處理時間，溫度較低時適當延長處理時間。