[發明專利]上皮細胞粘附分子的核酸適體及其制備方法

有效

• 申請號: 201210362899.2
• 申請日: 2012-09-24
• 公開（公告）號: CN102827845A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 楊朝勇;宋彥齡;安源;鄒遠;張薇婷;鄔杰;莊峙廈
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體，其特征在于所述上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體分別命名為EpCAM?A、EpCAM?B、EpCAM?C、EpCAM?D與EpCAM?Ccut，其序列如下：

EpCAMA：

agcgtcgaat?accactacag?tttggctctg?ggggatgtgg?aggggggtat?gggtgggagt????60

ctaatggagc?tcgtggtcag????????????????????????????????????????????????80

EpCAM?B：

agcgtcgaat?accactacag?agctcggggt?tttttggggt?tttttggggt?tttggtgggg????60

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EpCAM?C：

agcgtcgaat?accactacag?aggttgcgtc?tgtcccacgt?tgtcatgggg?ggttggcctg????60

ctaatggagc?tcgtggtcag????????????????????????????????????????????????80

EpCAMD：

agcgtcgaat?accactacag?ctccggggtt?tttgggggtt?tttctggggt?tttttggggc????60

taatggagct?cgtggtcag?????????????????????????????????????????????????79

EpCAM?Ccut：

Cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctg。

2.如權利要求1所述的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體，其特征在于所述上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體及基于上述結構做切短、延長、部分堿基替換的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體，所述上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體具有G四聚體結構或者莖環結構。

3.如權利要求1所述的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）合成單鏈DNA隨機寡核苷酸庫；以Ni微珠為基質，篩選除去DNA隨機寡核苷酸庫中的非特異性結合部分，以上皮細胞粘附分子EpCAM微珠篩選得到與上皮細胞粘附分子EpCAM特異結合的核酸序列；

2）將步驟1）所得與上皮細胞粘附分子EpCAM特異結合的核酸序列進行PCR擴增，PCR擴增產物以鏈酶親和素微珠為基質進行分離，通過堿變性解鏈，過濾，純化，即得用于次輪篩選的單鏈DNA文庫，形成次一級核酸文庫；

3）將步驟2）所得的單鏈DNA文庫進行下一輪篩選，經過12輪篩選后獲得目的寡核苷酸序列；克隆測序所述目的寡核苷酸序列，并通過流式分析法鑒定其與靶蛋白結合的特異性和親和力。

4.如權利要求3所述的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法，其特征在于在步驟1）中，所述單鏈DNA隨機寡核苷酸庫的兩端為固定序列，中間為40個堿基的隨機序列，即為5'-AGC?GTC?GAA?TAC?CAC?TAC?AG-40nt-CTA?ATG?GAG?CTC?GTG?GTC?AG-3'，庫容量為10¹⁵以上。

5.如權利要求3所述的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法，其特征在于在步驟2）中，所述PCR擴增的引物為：

引物1：5'-FAM-AGC?GTC?GAA?TAC?CAC?TAC?AG-3'；

引物2：5'-Biotin-CTG?ACC?ACG?AGC?TCC?ATT?AG-3'；

所述PCR擴增產物為3’端帶有生物素標記、5’端帶有FAM標記的雙鏈DNA文庫。

6.如權利要求1所述的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體作為與表達EpCAM蛋白的細胞系的核酸適配體。