[發明專利]雙液相系統發酵法降解植物甾醇制備雄烯二酮

無效

• 申請號: 201210360968.6
• 申請日: 2012-09-26
• 公開（公告）號: CN103255191A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 楊旭錦;石慧
• 申請（專利權）人: 北京明新高科技發展有限公司
• 主分類號: C12P33/02
• 分類號: C12P33/02;C12R1/32
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明利用發酵法降解植物甾醇制備雄烯二酮的方法屬于生物技術領域，涉及利用雙液相發酵系統進行發酵降解。

二、背景技術

雄烯二酮的化學結構式如下：

雄甾4-烯-3，17-雙酮(androst-4-ene-3，17-dione，簡稱雄烯二酮或AD)是甾體激素類藥物不可替代的中間體，對機體起著非常重要的調節作用，可以說幾乎所有甾體激素藥物都是以AD作為起始原料進行生產的，其可用來生產性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮質激素，又可用來合成氫化可的松、氧化潑尼松，黃體酮、雌烯醇、地塞米松等100余種藥物，也可以直接用于生產抗早孕米非司酮和各類計劃生育藥。如今AD不斷被一些發達國家用于開發和生產新的醫藥產品，如福美司坦等及類固醇類激素免疫抗原等，目前，全世界范圍內，AD的應用領域日益拓寬，用AD作原料生產的醫藥品種不斷增加。

Peterson和Murray在美國專利No.2,602,769中公開了一種用根霉屬真菌生產孕酮的II-a-羥化的方法；Kraychy在美國專利NO.3,684,657中公開了一種用分枝桿菌屬從包含17-烷基的類固醇生成雄-4-烯-3，17-二酮，雄-1，4烯-3，17-二酮和20a-羥甲基孕-1，4-二烯-3-酮的方法。50年代，美國Upjohn公司首先利用側鏈上有雙鏈的大豆甾醇和麥角甾醇為原料生產出雄甾-4-烯-3，17-雙酮(雄烯二酮)及雄甾-1，4-二烯-3，17-雙酮(雄烯二酮D)并以此作為合成甾體藥物的原料。20世紀60年代中期，由Sih等首先發現有些微生物可以選擇性降解切除甾醇的飽和側鏈而得到雄烯二酮和雄烯二酮D；70年代初，日本的有馬啟利用微生物降解膽甾醇生產雄烯二酮D獲得成功，受到許多制藥公司的高度重視。為了大量生產類固醇激素，研究者試圖使用甾醇作為唯一碳源分離微生物和改變甾醇結構用作發酵的底物，并用能防止甾醇核降解的化學添加劑來提高類固醇的收得率，這一努力己獲得很大進展。此外，埃及國家研究中心生物與天然產品化學系的和Sallam等研究發現，利用磷酸鹽緩沖液調節底物培養基pH值5.5～7.38可提高生物降解雄烯二酮、ADD的轉化率。Upjohn公司在美國專利No.4,293,644中描述了一種通過——分枝桿菌(ATCC29472)的突變株從多種類固醇中得到以高產量的雄-4-烯-3，17-雙酮(雄烯二酮)為主，并有少量雄-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的產物的方法。

國內在這方面也作了一系列的研究。王敬一，殷芝華，周維善在對β-谷甾醇側鏈的降解產生4-雄甾-3，17-雙酮的研究中發現：雄烯二酮產物的積累與培養基中葡萄糖的多少有關，結果證明葡萄糖過高不利于雄烯二酮的轉化。自80年代以來，微生物降解甾醇生成雄烯二酮甾體技術得到充分發展并在工業上得到廣泛應用。我國從國內外來源的諸多菌株中篩選到(Mycrobacteriumphlei93201)，在9a羥化酶抑制劑2，2’-聯吡啶存在下能將β-谷甾醇降解為ADD及微量雄烯二酮的菌株。

目前，AD的生產方法國內外有較大的差別，國外主要采用微生物法發酵轉化植物甾醇，而國內由于發酵工藝的不成熟，AD的生產廠家仍舊采用從薯蕷植物資源中提取薯蕷皂苷元(簡稱皂素)，化學合成雄烯二酮。薯蕷皂苷元主要是從穿地龍(一種野生名貴中藥材)中提取，消耗量大，已瀕臨枯竭，因此，采用該方法進行生產AD，嚴重受到原料的影響。國內也有科研機構在研究利用微生物法發酵轉化植物甾醇制得AD的生產方法，但是由于發酵量較小，難以達到工業生產的需求。

利用微生物發酵法降解植物甾醇工業化應用的一個難題是如何解決植物甾醇的溶解性問題：植物甾醇不溶于水，而在發酵過程中，菌株的生長、代謝、繁殖均是在水相中進行，甾醇不溶于水的物理特性降低了菌株對甾醇的利用率。

雙液相發酵的研究始于19世紀60年代，是指在發酵液中加入一種新的，與水不相溶的油相，例如以液態烷烴為底物進行SCP生產。目前，發酵生產中雙液相發酵體系有三類，第一類是以商品化的以烷烴或油脂為碳源的發酵體系；第二類是氧載體發酵體系，即將對氧有較高溶解度，但又不溶于水的有機溶劑(稱為氧載體)稱為氧載體加入到好氧發酵體系中，加快發酵體系的氧傳遞速度；第三類是近幾年開始開展研究的，在上述兩類雙液相發酵體系中引入一種固體載體或乳化劑，利用這種載體所具有的很強的與水和油的雙重吸附能力，增加雙液相間的接觸面積，從而提高傳質與發酵產率。

三、發明內容