[發明專利]用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法

有效

• 申請號: 201210355606.8
• 申請日: 2012-09-21
• 公開（公告）號: CN102879343A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 廖飛;楊曉蘭;劉紅博;黨濟政;龍高波;李元麗;劉霖
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/33;G01N21/35
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 謝殿武

1.一種用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，其特征在于：包括下列步驟：

a．確定用多波長吸收單通道同步測定多種酶活性所需顯色底物組合：

a1根據待測酶的專一性篩選滿足下列條件的顯色底物組合：所選顯色團能分別用于制備待測酶的顯色底物；所得這些顯色底物組合中，將顯色底物在對應待測酶作用下所得顯色產物相對該顯色底物的差吸收峰最大波長從大到小排列，相鄰的顯色產物差吸收峰最大波長之間相距大于30nm且盡量遠；在按顯色產物差吸收峰最大波長從大到小的排列中，除了顯色產物差吸收峰最靠近紅外端的顯色底物外，每個顯色底物在對應酶作用下所得顯色產物差吸收峰最大波長，都與此排列中某個顯色底物的最大等吸收波長相差小于25nm且盡量短；

a2用步驟a1所選顯色團分別合成待測酶的對應顯色底物并組合使用；

b．在一個反應混合物或酶反應體系即單反應通道中，同步啟動多個待測酶針對組合使用的顯色底物混合物對應顯色底物的專一催化反應；

c.選擇測量波長組合：以顯色產物差吸收峰最靠近紅外端的顯色底物為顯色底物A，在顯色底物A的顯色產物差吸收峰最大波長下測定該顯色產物吸收；在顯色底物A的等吸收波長處測定其余待測酶顯色產物或顯色底物的吸收；

d．在所選多個測量波長組合下，通過快速變換測量波長，多波長吸收同步測量實現同步跟蹤單通道中多個待測酶的反應過程；

e.基于無相互作用物質吸收的線性加和性建立消除反應通道中顯色物質吸收重疊干擾的數據處理方法，獲得消除吸收光譜重疊干擾后每個待測酶的顯色產物或顯色底物無干擾吸收變化曲線；如某個待測酶不受反應體系其它酶的產物及底物的干擾且其底物濃度在對應酶米氏常數的3倍以上，用經典初速度法分析其顯色產物或顯色底物無干擾吸收變化曲線確定初速度；如某個待測酶不受反應體系其它酶的產物及底物的干擾但所用顯色底物濃度在該酶米氏常數的5％以上而低于米氏常數的3倍，聯用經典初速度法和反應過程分析法分析其顯色產物或顯色底物無干擾吸收變化曲線確定初速度；當某個待測酶受反應體系中其自身和/或其它酶的底物和/或產物的干擾時，將描述反應體系動力學的微分速度方程組數值積分后分析活性受到干擾待測酶反應的顯色產物或顯色底物無干擾吸收變化曲線，確定其最大反應速度表示其活性，或據其微分速度方程和所得最大反應速度換算成底物濃度為起始底物濃度93％時初速度表示該待測酶的活性。

2.根據權利要求1所述用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，其特征在于：顯色產物相對顯色底物差吸收峰最大波長在300nm以上且其顯色底物吸收峰最大波長小于其對應顯色產物吸收峰最大波長，否則測定該酶催化逆反應的速度表示該酶的活性；顯色產?物差吸收峰最大波長相鄰的任兩個顯色底物中，顯色產物差吸收峰最大波長更靠近紅外端顯色底物的最大等吸收波長與顯色產物差吸收峰最大波長更靠近紫外端顯色產物的差吸收峰最大波長相等或相距不超過5nm為優化的顯色底物組合；所用顯色底物組合中每個顯色底物都僅被樣品中的一種待測酶作用生成對應顯色產物，而不被樣品中其它任何酶作用或作用效果不明顯；步驟b中，選擇適于同步測定活性的待測酶發揮作用的緩沖介質和反應條件，即緩沖介質pH位于pH?5.0到9.0之間且接近比活性最低待測樣品的最適pH，所用反應溫度在攝氏20到40度之間。

3.根據權利要求2所述的用多波長吸收單通道同步測量多種酶活性的方法，其特征在于：所述顯色底物包括天然顯色底物和非天然顯色底物；天然顯色底物包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；非天然顯色底物由顯色團和被酶識別基團組成，顯色團包括但不限于4-硝基苯酚、4-硝基苯硫酚、4-硝基苯胺、4-硝基-1-萘酚、4-硝基-1-萘硫酚、4-硝基-1-萘胺、2-萘酚、4-氯苯酚、玫紅酸或這些芳香酚及芳香胺的衍生物。