[發明專利]重組柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法及其應用

無效

• 申請號: 201210350637.4
• 申請日: 2012-09-19
• 公開（公告）號: CN102827846A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 盛望;張瀟;王曉雯;趙淼;曾毅;李澤琳;劉偉
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C12N15/41
• 分類號: C12N15/41;C12N15/81;C12N7/04;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及重組柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法，特別涉及利用經過密碼子優化的柯薩奇病毒B3型P1基因和3CD基因，通過酵母表達系統制備重組柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的方法。

背景技術

病毒性心肌炎（vital?myocarditis，VMC）是由多種病毒引起心肌的非特異性炎癥病變，病程較長，數月可康復，其中少數病人會轉變成慢性。能引起病毒性心肌炎的病毒中，最普遍的是腸道病毒與腺病毒（Yajima?T，Knowlton?KU.Viral?myocarditis:from?the?perspective?ofthe?virus.Circulation.2009,119(19):2615-2624.），而腸道病毒中的柯薩奇病毒B3（Coxsackievirus?B3，CVB3）是其主要病原體（Yuan?J,Yu?M,Lin?QW?et?al.Th17cells?contribute?to?viral?replication?in?coxsackievirus?B3-induced?acute?viral?myocarditis.J?Immunol.2010,185(7):4004-4010.）。在心肌炎與其晚期即擴張型心肌病病例中，有5-50%是由CVB3感染引起的（Maisch?B,Ristic?AD,Hufnagel?G，Pankuweit?S.Pathophysiology?of?viral?myocarditis:the?role?of?humoral?immune?response.CardiovascPathol.2002;11:112-22.）。

另外，柯薩奇病毒B3型與很多人類其它疾病相關，無菌性腦炎與胰腺炎，并且調查顯示CVB或許與胰島素依賴型糖尿病的發病相關（Andreas?Henke,Nadine?Jaraschand?Peter?Wutzler.Coxsackievirus?B3vaccines:use?as?an?expression?vector?for?prevention??of?myocarditis.Expert?Rev.Vaccines.2008,7(10),1557-1567.）。

柯薩奇病毒B3型屬小RNA病毒，其毒粒為二十面體形，立體對稱，呈球形狀，是裸露的核衣殼，直徑約為23-30nm，無包膜。病毒基因組為約7kb的單鏈RNA，其組成從5’端到3’端的方向依次為5’端非編碼區，P1區、P2區、P3區和一段3’端非編碼區。P1區編碼病毒的主要結構蛋白，即衣殼蛋白（capsule?protein），其轉錄及翻譯產物經蛋白酶水解后，最終得到4個蛋白產物，分別為VP4(1A)，VP2(1B)，VP3（1C）及VP1(1D)。主要的中和抗原位點就在P1區的VP1上，VP2和VP3上也含有一些中和型的抗原決定簇，但它們存在的區域是在非保守序列中。VP4序列呈高度保守，不暴露在衣殼的外表面，所以不具有中和性抗原決定簇。P2區呈現P2A、P2B和P2C三個部分。P2A蛋白的這一區域是起抑制宿主細胞mRNA轉錄作用的。P2B的功能與轉膜作用有關，而P2C蛋白據推測其參與病毒RNA基因組的復制。P3區中，VPg（P3A）前體通過加工成為成熟的VPg。P3C是一個蛋白酶，可以自動催化自我剪切釋放。3D是一個RNA合成酶，是在RNA復制過程中的依賴RNA的RNA多聚酶，它可以復制合成病毒的RNA。

研究人員已采用多種方法研究相關疫苗，并且利用動物模型證明了其預防急性感染或心肌炎的潛能，其中包括亞單位疫苗，滅活病毒疫苗，減毒活疫苗或DNA疫苗。然而，這些方法存在危險性，甚至存在不能刺激機體產生理想的免疫反應的可能。例如，減毒或滅活病毒疫苗存在逆轉成有毒力的形式的危險或者不完全滅活，將導致接種者患病。目前，還沒有預防感染CVB3的特效藥或疫苗上市，因此，研制CVB3預防性疫苗對于控制病毒性心肌炎的流行具有重要意義。而病毒樣顆粒在形態上和真實的病毒類似，并且不含有潛在的致病病毒基因組，所以病毒樣顆粒為抗病毒預防性疫苗的開發提供了理想的備選方案。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法。并且本方法可應用于柯薩奇B型病毒（B1-B6）的病毒樣顆粒制備。

本發明所提供的柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法包括如下步驟：

1）將柯薩奇病毒B3型的P1基因和3CD基因克隆到目的質粒中，得到重組表達載體；