[發(fā)明專利]含蛋白轉導域的融合多肽突變體及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210350193.4
• 申請日: 2012-09-20
• 公開（公告）號: CN102863538A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設計）人: 黃晨;孫世仁;王漢民;張鵬;杜銳;許國雙;劉曉渭;劉宏寶;何麗潔;李嶸
• 申請（專利權）人: 黃晨
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;A61K38/16;A61K47/48;A61K48/00;A61P13/12
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 蔣常雪

技術領域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，涉及含有蛋白轉導域TAT、Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)的融合多肽突變體，還涉及編碼該融合多肽突變體的cDNA序列及其衍生物，包含此類cDNA序列的重組表達載體，用此類重組表達載體轉化的宿主細胞，以及用于制備此類重組蛋白質(zhì)和它們的衍生物的方法。本發(fā)明還涉及該融合蛋白突變體的構建方法及其應用。

背景技術

腎臟纖維化是不同病因(包括炎癥、損傷、藥物、糖尿病和遺傳因素、衰老等)所導致慢性腎臟疾病的最終共同結局。各種進展性腎臟疾病，無論其原發(fā)病如何，最終都將導致腎臟纖維化，進展為終末期腎功能衰竭，并必須依靠透析或腎移植維持生命。因此，研究腎臟纖維化的發(fā)病機制、探索能夠緩解腎臟纖維化進程或逆轉腎臟纖維化的有效治療手段、延緩終末期腎衰的發(fā)生是腎臟疾病研究領域亟待解決的重要臨床問題。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，在眾多細胞因子、體液、代謝和血流動力學因素中，轉化生長因子β1(Transforming?growth?factor-β1，TGF-β1)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone?morphorgenic?protein，BMP)及其下游的smad信號轉導通路在腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展中起著決定性作用。通過阻斷TGF-β1信號轉導通路和(或)增強BMP7信號來逆轉或延緩腎臟纖維化成為當前研究的熱點，并已在大量的體外及動物實驗中得以證實。但目前已經(jīng)建立的阻斷TGF-β1信號轉導通路的策略在抑制腎臟纖維化的同時也對機體對抗腎臟炎癥的作用通路產(chǎn)生了抑制作用，因此難于在臨床推廣應用。BMP7在治療急性和慢性腎臟疾病中雖顯示出良好的效果，然而BMP7的活性形式為二聚體，含有6個分子內(nèi)二硫鍵和一個分子間二硫鍵，使用基因工程技術制備時蛋白復性成本過高，不能被廣大患者接受。

從2009年始，本課題組一直致力于探索TGF-β1通路抑制蛋白SARA阻斷腎纖維化的作用研究，探索能夠替代基因治療及BMP7并能有效治療、緩解腎臟纖維化的蛋白藥物。合成的SARA融合蛋白雖具一定的功能活性，但蛋白表達不穩(wěn)定，以包涵體形式存在，沉淀蛋白須經(jīng)復性才可使用，但復性常使蛋白性質(zhì)發(fā)生變化而失去功能，不利于今后的藥物生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在原有SARA融合蛋白的工作基礎上，對SARA羧基末端的Smad結合作用域——SARA肽適體(SARA/SBD)進行改造，獲得一種含蛋白轉導域TAT、Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)的新的融合多肽突變體。

其中，所述蛋白轉導域TAT為人類免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)的反式激活蛋白(transactivator?of?transcription，TAT)改造而來，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1(YARAAARQARA)。其中，Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)與人SARA/SBD同源，其突變體是通過將Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)氨基酸序列的第51位由A突變?yōu)門以及第54位由A突變?yōu)镻而獲得的；該突變體的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2(MSASSQSPNPNNPAEYCSTIPPLQQAQASGALSSPPPTVMVPVGVLKHPGTEVPQPR)。其中，所述連接肽包含至少1個、3個、5個、7個、9個、15個、25個氨基酸，如其氨基酸序列為SGGGS(SEQ?ID?No：3)。

本發(fā)明還涉及該融合蛋白突變體的氨基酸序列，如SEQ?ID?NO：4所示(YARAAARQAR?ASGGGSMSAS?SQSPNPNNPA?EYCSTIPPLQ?QAQASGALSS?PPPTVMVPVG?VLKHPGTEVP?QPR)；本發(fā)明還涉及編碼該融合蛋白突變體的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示；以及該核酸分子的cDNA序列；該核酸分子或其cDNA與啟動子構建的表達盒；包含該核酸分子、或其cDNA、或其表達盒的質(zhì)粒或載體，其中該質(zhì)?；蜉d體是表達載體；還涉及宿主細胞，其包含該核酸分子、cDNA序列、表達盒、或質(zhì)?；蜉d體。

本發(fā)明還涉及制備該融合蛋白突變體的方法，其中所述方法包括：1)提供核酸，所述核酸包含可在生物中表達的編碼所述融合蛋白突變體的核苷酸序列；2)在所述生物中表達所述核酸以形成TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體；和3)純化所述TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體。