[發明專利]骨骼肌特異性表達PEPCK-C以改變小鼠運動能力和代謝功能的轉基因載體

無效

• 申請號: 201210345550.8
• 申請日: 2012-09-18
• 公開（公告）號: CN102827874A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 戴一凡;馮瑋;任媛媛;劉乃豐
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學;南京醫科大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種骨骼肌特異性表達PEPCK-C以改變小鼠運動能力和代謝功能的轉基因載體。

背景技術

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate?carboxykinase,PEPCK）是催化糖異生(gluconeogenesis)反應的一個限速酶，即由草酰乙酸和GTP轉變為磷酸烯醇式丙酮酸、GDP及CO2的反應。目前已知有兩種PEPCK同工酶，分別是PEPCK-M（mitochondrial?form）和PEPCK-C(cytosolic?form)，PEPCK-C（也叫PCK1）在糖異生中有重要作用，對其研究也更多。目前PEPCK-C已成為肝臟糖異生的一明確的標記物，肝臟中此基因的轉錄水平成為臨床上2型糖尿病評價的重要指標，即如果PEPCK-C的mRNA表達增加，糖異生的速率就一定會增加。PEPCK-C基因編碼了一個63kDa的蛋白酶，主要在肝臟和腎皮質中表達，并催化糖異生反應；在肝臟以及白色和棕色脂肪組織中，PEPCK-C還參與甘油異生反應(glyceroneogenesis)；此外，PEPCK-C在流失反應(cataplerosis)中起作用，以去除檸檬酸循環中的陰離子；PEPCK-C酶同時還廣泛存在于哺乳動物的組織內，包括小腸、結腸、乳腺、腎上腺、肺和肌肉。但是其在這些組織中的代謝作用仍未明確。

PEPCK-C在不同組織中的活性是在轉錄水平上調控的。例如，在肝臟中特異表達PEPCK-C基因只需要從-460bp到+69bp的啟動子序列，營養物質和荷爾蒙可調控PEPCK-C基因的轉錄水平，cAMP、糖皮質激素和胰島素都能調節PEPCK-C基因的轉錄，并已確定了它們在PEPCK-C啟動子上的相對應的調控序列。

由于PEPCK-C在不同組織中的主要功能不同，所以不同的組織特異性的基因敲除或過表達引起多種不同的表型。正常情況下，PEPCK-C在骨骼肌中不表達或表達量很低。PEPCK-C用6個ATP的能量來催化丙酮酸轉變為一個葡萄糖，而在骨骼肌中的無氧酵解每分解一個葡萄糖，卻只能生成2個ATP。我們預期在骨骼肌中過度表達PEPCK-C，血液中的甘油三酯和游離脂肪酸可能都會向骨骼肌運輸，提供更多的能量，并可能影響機體的代謝水平。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種能在骨骼肌中特異性表達PEPCK-C以改變小鼠運動能力和代謝功能的轉基因載體。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種能在骨骼肌中特異性表達PEPCK-C的轉基因片段包含小鼠的α-骨骼肌肌動蛋白（α-skeletal?actin）基因的啟動子、小鼠PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因（bGH）的3’端不翻譯區域，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因—嘌呤霉素（Puromycin）基因和原核細胞中篩選用的抗性基因—氨芐青霉素（ampicillin）基因（見圖2）。

3.3kb的小鼠α-骨骼肌肌動蛋白（α-skeletal?actin）啟動子可保證下游的基因在骨骼肌中特異性表達。

本發明構建的骨骼肌特異表達鼠PEPCK-C的轉基因載體的全序列如SEQ?ID?No：1所示，其中228-3525堿基為α-骨骼肌肌動蛋白（α-skeletal?actin）基因的啟動子區，第3604-5472堿基為鼠PEPCK-C編碼區，第6386-6610堿基為bGH?3’端不翻譯區，第6693-7292堿基為嘌呤霉素（Puromycin）抗性基因，第9337-10336堿基為氨芐青霉素（Ampicillin）抗性基因。

本發明的轉基因載體可用于體細胞克隆，以構建能夠改變小鼠運動能力和代謝功能的PEPCK-C轉基因小鼠。

附圖說明

圖1是本發明的技術流程圖。

圖2是本發明構建的pST229轉基因載體的示意圖。

具體實施方式

根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。