[發(fā)明專利]人白細胞介素-12的編碼基因、真核宿主細胞和表達方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210345021.8
• 申請日: 2012-09-17
• 公開（公告）號: CN102876684A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設計）人: 趙毅;李友海;章方良;柳振宇
• 申請（專利權）人: 青島康立泰藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N15/24
• 分類號: C12N15/24;C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 龐東成;李棟修

技術領域

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及人白細胞介素-12(IL-12)的編碼基因、真核宿主細胞和表達方法，具體而言，本發(fā)明涉及對人白細胞介素-12的編碼基因進行優(yōu)化，從而能夠使IL-12在真核宿主細胞，特別是中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中穩(wěn)定高效表達，尤其是在無血清條件下穩(wěn)定高效表達。

背景技術

白細胞介素-12(IL-12)于1989年和1990由Trinchieri和Gately等發(fā)現，起初命名為NK細胞刺激因子(NKSF)和細胞毒淋巴細胞成熟因子(CLMF)，1991年統(tǒng)一命名為白介素-12。

白細胞介素-12是一種70kDa的異二聚體，由兩條共價連接的多肽鏈組成，一條為35kDa(P35亞基)，另一條為40kDa(P40亞基)。P35亞基由多種細胞產生，包括T、B淋巴細胞、NK細胞和大單核細胞等，而P40鏈主要由激活的單核細胞和B細胞產生，P35和P40單獨存在時均無任何IL-12的生物活性。

IL-12具有調節(jié)和參與免疫應答細胞的活性，刺激NK細胞和T細胞產生干擾素-伽瑪(IFN-γ)，促進Th1細胞的分化，是連接固有免疫和獲得性免疫的核心因子。同時，

IL-12可促進造血功能的恢復，用于機體造血功能的降低導致的疾病，如急性放射病、放射性治療、化學治療等。另外，IL-12還具有抗腫瘤，抗病毒的效果，具有良好的臨床應用前景。

在目前報道的利用真核細胞表達產生重組IL-12的方法中，重組IL-12的表達強度仍不令人滿意。

以下表1列出了現有技術相關技術的培養(yǎng)條件和最高產量。

表1現有技術的培養(yǎng)條件和最高產量

如能提高rhIL-12的表達量，會推動rhIL-12的產業(yè)化。

但是，現有技術，都是對P35、P40如何插入載體能夠促進表達進行探索，未從基因序列的優(yōu)化方面考慮。忽視了目前醫(yī)藥蛋白藥物的宿主細胞是非人源的細胞，如鼠源的細胞，例如最為廣泛使用的中國倉鼠卵巢細胞(CHO，Chinese?Hamster?Ovary?Cells)。人源IL-12的序列未必能最佳的利用鼠源細胞的蛋白表達系統(tǒng)。沒有從基因序列的優(yōu)化方面考慮。

雖然根據宿主細胞而優(yōu)化待表達蛋白的基因序列的方法已有報道，例如，名稱為“一種人白介素-10基因序列及含該基因序列的大腸桿菌”的中國專利申請公開102268407A，但是其提供的是一種能高效表達于微生物的人白細胞介素-10基因序列。目前尚沒有人嘗試優(yōu)化人白介素-12的序列，使之適宜在真核細胞，特別是CHO細胞中的表達，尤其是在無血清條件下的表達。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種人白細胞介素-12的編碼基因，其通過將人IL-12的基因序列優(yōu)化而形成，適合在在真核細胞，特別是鼠源細胞(如CHO細胞)中表達，從而提高表達效率，增加蛋白的產量。

本發(fā)明的人白細胞介素-12的編碼基因，包含

(a).編碼人白細胞介素-12的P35亞基的核苷酸序列SEQ?ID?NO：9或其互補核苷酸序列以及編碼人白細胞介素-12的P40亞基的SEQ?ID?NO：10或其互補核苷酸序列；或者

(b).編碼人白細胞介素-12的P35亞基的核苷酸序列SEQ?ID?NO：21或其互補核苷酸序列以及編碼人白細胞介素-12的P40亞基的SEQ?ID?NO：22或其互補核苷酸序列。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種表達人白細胞介素-12的真核宿主細胞，其包含

(a).具有編碼P35亞基的核苷酸序列SEQ?ID?NO：9或其互補核苷酸序列的第一表達載體和具有編碼P40亞基的核苷酸序列SEQ?ID?NO：10或其互補核苷酸序列的第二表達載體；或者

(a).具有編碼P35亞基的核苷酸序列SEQ?ID?NO：21或其互補核苷酸序列的第一表達載體和具有編碼P40亞基的核苷酸序列SEQ?ID?NO：22或其互補核苷酸序列的第二表達載體。

本發(fā)明的又一個目的在于提供一種人白細胞介素-12的表達方法，其特征在于，所述方法包括

(a).分別構建包含編碼P35亞基的核苷酸序列SEQ?ID?NO：9或其互補核苷酸序列的pGN-35質粒和包含編碼P40亞基的核苷酸序列SEQ?ID?NO：10或其互補核苷酸序列的pCDNA3.1質粒；或者