[發明專利]一種培育富含花青苷煙草的方法及其應用

有效

• 申請號: 201210338263.4
• 申請日: 2012-09-13
• 公開（公告）號: CN103045642A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 孫崇德;徐昌杰;殷學仁;劉曉芬;李鮮;張波;陳昆松
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明屬于植物分子生物技術和基因工程領域，涉及一種培育富含花青苷煙草的方法及其應用。?

背景技術

吸煙嚴重影響人體健康。吸煙不僅可誘導心血管病、慢性肺病和癌癥，而且會增加傳染病的發生概率，直接導致嚴重流行性感冒、侵入性肺炎和結核病的發病幾率上升；引起眾多的生殖并發病，包括不育、自發性流產、嬰兒體重過輕和夭折等綜合癥狀；使人體產生胰島素抗性，是糖尿病發病的重要因素，而且會加速吸煙者患血管病的進程；還會影響手術后身體的恢復，包括延緩傷口愈合和增加傷口感染的幾率等。?

隨著人們健康觀念的不斷提升，發達國家中煙民的數量有所減少，然而在較多發展中國家中，仍有超過40%?人口的煙民。多數煙民都有嚴重的煙癮，從而無法通過戒煙來避免吸煙引起的疾病。對于這部分煙民來說，選擇含較少有害物質的煙草可能是一個可行的策略。?

花青苷屬于黃酮類化合物，廣泛存在于絕大部分陸生植物的液泡中，是紅色、藍色和紫色色澤的主要構成物?；ㄇ嘬站哂卸喾N重要功能。除作為天然色素外，花青苷還具有很強的抗氧化、清除氧自由基的能力，是具有保健功能的天然活性物質，被譽為繼水、蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質之后的第七大必需營養。長期以來，花青苷已成為植物營養素或食品健康的重要標志。由于其具有極高的抗氧化活性，花青苷對心血管疾病、神經元和衰老相關疾病和癌癥等均具一定預防功效。本實驗室研究發現，楊梅果實中花青苷等酚類物質的含量與抗氧化活性呈顯著正相關關系，其中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷是楊梅果實中主要的抗氧化物質；通過口服糖耐量試驗(OGTT)發現，楊梅果實花青苷粗提物可顯著降低大鼠血糖，改善糖尿病鼠的糖耐量能力；楊梅果實花青苷可抑制腫瘤細胞MMP-2蛋白的表達，從而抑制胃癌腫瘤細胞的活性。此外，花青苷還可有效抑制肥胖和降低血脂，改善血糖平衡，促進視紫紅質再生進而增強視力敏銳性，預防大腦中樞栓塞和缺血癥狀。因而花青苷成為天然色素中最具有發展前景的一類色素。?

花青苷的代謝途徑已較為透徹，目前研究已達到轉錄調控的水平。即在花青苷的合成代謝過程中，相關的合成基因呈現較嚴格的時間和空間上的協同表達現象，經研究發現，這種現象是由轉錄調控基因統一調節的?；ㄇ嘬蘸铣上嚓P的轉錄調控基因主要涉及三大轉錄因子家族，分別是R2R3-MYB轉錄因子、basic?helix-loop-helix（bHLH）轉錄因子和WD40蛋白。由這三大轉錄因子構成的MYB-bHLH-WD40（MBW）轉錄復合體，對花青苷生物合成的后期合成基因的表達的轉錄調控尤為顯著。其中，MBW?轉錄復合體中MYB?和bHLH?轉錄因子對花青苷的合成調控較為特異。?

發明內容

本發明的目的是提供一種培育富含花青苷煙草的方法，使得減輕吸煙帶來的健康危害成為可能。以楊梅果實中已確認可調控花青苷合成的MrMYB1?和MrbHLH1為例，對該發明方法進行具體闡述。本發明方法同樣適用于楊梅以外其他可調控花青苷合成的MYB?和bHLH?基因。?

本發明的具體實施步驟如下：?

1、表達載體構建：根據已確認的MrMYB1（SEQ：NO.?1）的序列全長設計含限制性內切酶酶切位點的引物對SEQ：NO.?2和SEQ：NO.?3，根據已確認的MrbHLH1（SEQ：NO.?4）的序列全長設計含限制性內切酶酶切位點的引物對SEQ：NO.?5和SEQ：NO.?6。以楊梅成熟果實cDNA為模板，PCR擴增兩個基因的開放性閱讀框，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，回收后經相應限制性內切酶處理，酶切產物再次用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收，然后連接到同樣經相應限制性內切酶處理的pGreenII?SK表達載體上，分別進行MrMYB1和MrbHLH1過量表達載體的構建。