[發明專利]一種培育富含花青苷煙草的方法及其應用

有效

• 申請號: 201210338263.4
• 申請日: 2012-09-13
• 公開（公告）號: CN103045642A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 孫崇德;徐昌杰;殷學仁;劉曉芬;李鮮;張波;陳昆松
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

1.一種培育富含花青苷煙草的方法，其特征在于，通過以下步驟實現：

（1）表達載體構建：根據序列為SEQ：NO.?1的MrMYB1的序列全長設計含限制性內切酶酶切位點的序列為SEQ：NO.?2和SEQ：NO.?3的引物對，根據序列為SEQ：NO.?4的MrbHLH1的序列全長設計含限制性內切酶酶切位點序列為SEQ：NO.?5和SEQ：NO.?6，PCR的引物對，擴增兩個基因的開放性閱讀框，然后采用相應的內切酶處理擴增產物和表達質粒pGreenII?SK，最后通過連接相對應的PCR產物和質粒，分別進行MrMYB1和MrbHLH1過量表達載體的構建；

（2）雙價表達載體構建：根據表達質粒pGreenII?SK序列為SEQ：NO.?7，設計序列為SEQ：NO.?8和SEQ：NO.?9的引物對，擴增CaMV?加尾信號序列，引物對SEQ：NO.?10和SEQ：NO.?11擴增35S啟動子序列，根據融合PCR技術原理設計引物對SEQ：NO.?12和SEQ：NO.?13擴增MrMYB1的開放性閱讀框片段，引物對SEQ：NO.?14和SEQ：NO.?15擴增MrbHLH1的開放性閱讀框片段，應用融合PCR技術進行含MrMYB1-MrbHLH1雙價載體的構建，第一輪PCR分別擴增出CaMV加尾信號、35S啟動子、MrMYB1和MrbHLH1序列，第二輪PCR擴增出中間產物模板，第三輪PCR擴增出最終融合目的片段；

（3）基因的功能預測：應用農桿菌介導的煙草葉片瞬時表達技術，將含有各表達載體的農桿菌滲透液，輸入煙草葉片表皮細胞內，植株置于溫室培養8天后觀察葉片中花青苷合成情況，若輸入孔周圍有花青苷積累，說明輸入葉片的基因具有誘導花青苷積累的功能；

（4）煙草轉基因技術：將采用瞬時表達技術篩選的含有效基因表達載體的農桿菌菌株浸染帶有傷口的無菌煙草組培苗葉片，然后置于含抗生素的不定芽誘導培養基培養4周，再轉到含抗生素的根誘導培養基上培養4周，得到完整的轉基因植株，最后經過煉苗，將植株置于室外培養至開花結果。

2.根據權利要求1所述的一種培育富含花青苷煙草的方法，其特征在于，所述步驟（2）中雙價表達載體構建的方法是，首先根據表達質粒pGreenII?SK的序列信息擴增出CaMV加尾信號和35S啟動子片段，以‘荸薺’種楊梅的cDNA為模板擴增出MrMYB1和MrbHLH1的開放性閱讀框片段；第二輪PCR擴增出融合這些片段的中間產物；最后以中間產物為模板，SEQ：NO.?8和SEQ：NO.?15為引物對，擴增出融合的MrMYB1?-?CaMV?term?-?CaMV?35S?-?MrbHLH1片段；將所得融合片段插入到的表達質粒pGreenII?SK的多克隆位點內，完成雙價表達載體的構建。

3.根據權利要求1所述的一種培育富含花青苷煙草的方法，其特征在于，所述步驟（3）中基因功能預測的方法為煙草葉片瞬時表達技術；將含有各表達載體的農桿菌菌株，分別與含p19質粒的農桿菌菌株等比例混合，輸入到煙草葉片遠離中心葉脈的表皮細胞內；煙草植株置于16h：8h光暗周期、25^oC、75%空氣濕度的條件下培養8天，觀察花青苷積累情況。

4.根據權利要求1所述一種培育富含花青苷煙草的方法，其特征在于，所述步驟（4）中的煙草轉基因方法為：選取無菌煙草組培苗的幼嫩真葉，置于用浸染液懸浮的農桿菌菌液內，切成2-3?mm長寬的葉片，先在無選擇壓的培養基上共培養2天，然后經過誘芽、誘根培養成完整植株。

5.根據權利要求1所述的方法在培育富含花青苷的煙草中的應用。